iNOS抑制剂AG和1400W对大鼠肺成纤维细胞CTGF表达和肌成纤维细胞表型转化的影响

摘要

目的：肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是一种由多种因素引起的肺间质性病变。肺纤维化时，肺间质中的胶原纤维大多由肌成纤维细胞(Myofibroblast，MFb)合成。肌成纤维细胞是以表达α-平滑肌肌动蛋白(smooth musle actin，α-SMA)为标志的成纤维细胞。氨基胍(aminoguanidine，AG)是诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase，iNOS)抑制剂；1400W是一种选择性较强的高效iNOS抑制剂。AG或1400W对于离体肺成纤维细胞结缔组织生长因子(connective tissuegrowth factor，CTGF)及肌成纤维细胞表型转化的影响目前尚未见报道。RNA干扰(RNA interference，RNAi)作为一种新兴的基因水平调控技术，通过合成特异性小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)沉默靶基因的表达，已成为基因功能研究和基因治疗的全新手段。因此，本实验通过离体观察AG和1400W对大鼠肺成纤维细胞CTGF及α-SMA蛋白表达的影响；并利用CTGF siRNA技术阐明AG和1400W对肺成纤维细胞CTGF及肌成纤维细胞表型转化影响的机制，为评价iNOS抑制剂在肺纤维化防治中的作用提供资料。
　　方法：体外分离培养原代雄性SD大鼠(130-150g)肺成纤维细胞；MTT法测定AG和1400W对肺成纤维细胞存活率的影响；Western Blot法测定肺成纤维细胞CTGF及α-SMA的蛋白表达。
　　结果：
　　1 TGF-β诱导肺成纤维细胞CTGF蛋白表达的最佳时间点
　　基础状态的肺成纤维细胞是指正常培养的肺成纤维细胞。与相应的对照组相比，24 h、48 h、72 h CTGF的表达均上调(P<0.01)，与24 h、72 h时间点相比，48 h时间点上调更明显(P<0.05)。因此，本实验将48 h定为TGF-β诱导基础状态的肺成纤维细胞CTGF蛋白表达的最佳时间点。
　　TGF-β处理后的细胞是指经TGF-β(10 ng/ml)刺激48 h的肺成纤维细胞。与相应的对照组相比，TGF-β诱导24 h、48 h、72 h时TGF-β处理后的肺成纤维细胞CTGF蛋白表达均上调(P<0.05，P<0.01)。
　　2不同浓度的AG和1400W对基础状态及TGF-β处理后的肺成纤维细胞存活率的影响
　　与对照组相比，1 mmol/L AG对两种状态的肺成纤维细胞的作用均无无统计学意义(P>0.05)，而当AG浓度达到5 mmol/L、10 mmol/L、20mmol/L、30 mmol/L、40 mmol/L或50 mmol/L时，其存活率显著增高(P<0.01，P<0.001)。
　　与对照组相比，1400W随浓度变化对两种状态的肺成纤维细胞存活率的影响均无统计学意义(P>0.05)。
　　3 AG和1400W对肺成纤维细胞CTGF及α-SMA蛋白表达的影响
　　3.1不同浓度的AG和1400W对基础状态的肺成纤维细胞CTGF蛋白及α-SMA表达的影响
　　与对照组相比，0.1 mmol/L的AG对基础状态的肺成纤维细胞CTGF及α-SMA蛋白表达无显著性差异(P>0.05)，1 mmol/L的AG明显上调CTGF及α-SMA蛋白表达(P<0.01)，而10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L的AG则剂量依赖性下调肺成纤维细胞的CTGF及α-SMA蛋白表达(P<0.05，P<0.01)。说明低浓度AG(1 mmol/L)诱导基础状态的肺成纤维细胞CTGF及α-SMA蛋白表达上调，而高浓度AG(10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L)抑制其表达。
　　与对照组相比，20 nmol/L的1400W明显上调肺成纤维细胞CTGF及α-SMA蛋白表达(P<0.05)，40 nmol/L和80 nmol/L均无显著性差异(P>0.05)，160 nmol/L显著下调其表达(P<0.05)。说明低浓度1400W(20nmol/L)诱导基础状态的肺成纤维细胞CTGF及α-SMA蛋白表达上调，而高浓度1400W(160 nmol/L)抑制其表达。
　　3.2不同时间点AG和1400W对基础状态的肺成纤维细胞CTGF及α-SMA蛋白表达的影响
　　与相应的对照组相比，AG(1 mmol/L)24 h肺成纤维细胞CTGF及α-SMA蛋白表达上调无显著性差异(P>0.05)，48 h、72 h CTGF蛋白表达均上调(P<0.001，P<0.05)，48 h、72 hα-SMA蛋白表达均明显上调(P<0.01，P<0.05)。与72 h时间点相比，48 h时间点CTGF及α-SMA蛋白表达上调更明显(P<0.01，P<0.05)，因此，本实验将48 h定为AG(1 mmol/L)对肺成纤维细胞CTGF及α-SMA蛋白表达的最佳时间点。
　　与相应的对照组相比，1400W(20 nmol/L)24 h、48 h CTGF及α-SMA蛋白表达均上调(P<0.05，P<0.01)，72h时间点无明显变化(P>0.05)。与24 h时间点相比，48 h CTGF及α-SMA蛋白表达上调更明显(P<0.05)。因此，48 h CTGF及α-SMAF蛋白表达上调最明显。
　　4不同浓度的AG和1400W对TGF-β处理的肺成纤维细胞CTGF及α-SMA蛋白表达的影响
　　与基础状态的肺成纤维细胞组相比，TGF-β处理组CTGF及α-SMA蛋白表达均上调(P<0.01)。与TGF-β处理组相比，TGF-β+AG(1 mmol/L)组CTGF及α-SMA蛋白表达无显著差异(P>0.05)，TGF-β+AG(10mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L)则剂量依赖性下调肺成纤维细胞CTGF及α-SMA蛋白表达(P<0.05，P<0.04)。说明低浓度1mmol/L AG对TGF-β处理的肺成纤维细胞CTGF及α-SMA蛋白表达无明显影响，高浓度10mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L AG抑制其表达。
　　与基础状态细胞组相比，TGF-β处理组CTGF及α-SMA蛋白表达明显上调(P<0.01)。与TGF-β组相比，TGF-β+1400W(10 nmol/L、20 nmol/L)组CTGF及α-SMA蛋白表达无显著性差异(P>0.05)，TGF-β+1400W(40nmol/L、80 nmol/L)组抑制CTGF及α-SMA蛋白表达(P<0.05，P<0.01)。
　　5抑制效果最佳的CTGF siRNA特异靶序列的筛选
　　与NC siRNA相比，6737 siRNA组CTGF和α-SMA的表达均有所下调(P<0.01，P<0.05)，6738 siRNA组CTGF和α-SMA的表达下调(P<0.05)，两组对CTGF抑制率分别为(42±5)%、(29±4)%。以6737 siRNA下调最明显(P<0.01)。说明6737 siRNA对CTGF的抑制效果最佳。
　　6 CTGF-siRNA对AG或1400W诱导的肺成纤维细胞CTGF及α-SMA蛋白表达的影响
　　与NC组相比，6737 siRNA下调CTGF及α-SMA蛋白表达(P<0.05)。与AG(1 mmol/L)组相比，AG+NC组对CTGF及α-SMA蛋白表达无明显影响(P>0.05)。与AG+NC组相比，AG+6737 siRNA组CTGF及α-SMA蛋白表达明显下调(P<0.01)，AG+6738 siRNA组CTGF及α-SMA蛋白下调(P<0.05)。说明6737 siRNA、6738 siRNA对AG诱导的CTGF的表达均有抑制作用，抑制率分别为(41±6)%、(24±4)%，并导致α-SMA蛋白表达下调。
　　与1400W+NC组相比，1400W+6737 siRNA组和1400W+6738 siRNA组CTGF及α-SMA蛋白表达均明显下调(P<0.01，P<0.05)。
　　结论：
　　1低浓度的AG(1 mmol/L)和1400W(20 nmol/L)可诱导基础状态的肺成纤维细胞CTGF蛋白表达，并促进肌成纤维细胞表型转化；而高浓度AG(10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L)和1400W(160 nmol/L)可下调肺成纤维细胞CTGF及α-SMA蛋白表达。
　　2低浓度的AG(1 mmol/L)和1400W(20 nmol/L)对TGF-β诱导的肺成纤维细胞CTGF及α-SMA蛋白表达无明显影响；高浓度的AG(10mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L)抑制其表达。
　　3 CTGF siRNA可阻断AG(1 mmol/L)和1400W(20 nmol/L)诱导的肺成纤维细胞CTGF蛋白表达上调，并导致α-SMA蛋白表达下调。说明CTGF蛋白表达的下调阻碍了肺肌成纤维细胞表型转化。