中波紫外线诱导人表皮Langerhans细胞凋亡及EGCG抗凋亡机制的研究

摘要

背景和目的在25年前就发现紫外线可以影响免疫系统。光生物学领域大量研究证实了紫外线可介导免疫抑制甚至可诱发皮肤癌前期病变及皮肤癌。日光辐射的免疫抑制作用主要是由其中的中波紫外线(UVB)介导，虽然最近也有一些实验证实长波紫外线也可以影响免疫系统，但这方面的证据少而不全面。 Langerhans细胞为树突状细胞(DC)系统中一种独特类型，它是皮肤中主要的抗原递呈细胞，在免疫系统中起着重要作用。因此也是紫外线所致免疫抑制的主要靶细胞。UVB辐射后，紫外线暴露部位LC减少并与紫外线的辐射有剂量依赖性，而引流淋巴结获得的LC有紫外线介导的DNA损伤。这些都证实了紫外线对LC的损伤作用。由于表皮中LC仅占细胞总数的2﹪～5﹪，其分离纯化比较困难，但其表面的CD1a为人表皮LC特异性标记分子，可用来鉴定及分选表皮LC，故本实验拟采用联合密度梯度离心与免疫磁珠的方法以获得较高纯度及优良活性的LC。 凋亡是机体主动地、高度有序的清除无用细胞(包括损伤、衰老和突变细胞)的过程，它是机体维持自身稳定的基本生理机制。细胞凋亡与细胞周期密切相关。细胞周期(cellcycle)是连续分裂的细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历的整个过程。阻断细胞周期进程可引起凋亡；而凋亡也常伴随有生长阻滞。 p53蛋白是人体中重要的“基因组卫士”。它可调节细胞生长、监视肿瘤细胞产生、诱导细胞凋亡。在正常细胞中，p53蛋白主要位于胞浆中，并与JUK或MDM2结合。UVB损伤细胞后，p53蛋白经磷酸化修饰后，脱离了MDM2及JUK，稳定性及活性均提高，半衰期延长，累积量增加。进入核内，作为转录因子，调控一系列下游靶基因的表达。可使细胞从增殖状态进入周期阻滞，等待DNA修复；若DNA不能及时修复，则通过促使Bax和Bcl-2结合而促进线粒体内细胞色素c外泄而激活细胞凋亡通路。为了探讨UVB所致的皮肤LC减少是否与UVB对LC光损伤有关以及表没食子儿茶素没食子酸脂(EGCG)可否保护LC免受UVB损伤，首先我们用UVB辐射分离纯化后获得的LC，观察其凋亡率变化，同时观察加入EGCG后凋亡率的变化。为了进一步探讨EGCG可有效抗凋亡的机制。我们选择了细胞周期，以及细胞凋亡信号传导通路上重要的信号调节蛋白p53作为研究对象，对EGCG抗凋亡机制作进一步的探讨。 绿茶提取物茶多酚(Greenteapolyphenols，GTP)的主要活性成份表没食子儿茶素没食子酸脂(epigallocatechingallate，EGCG)等有着广泛的生物学效应，如吸收紫外线、抗炎、清除氧自由基、抗过氧化、抗凋亡及抗肿瘤等作用。本课题小组已对中波紫外线照射原代角质形成细胞及其细胞株和成纤维细胞等所造成的光损伤与EGCG的光保护作用进行了系列研究。但对LC的研究目前国内外都较少。本项目旨在研究EGCG对分离纯化的人LC所具有的光保护作用及作用机理。 方法1.分离纯化人表皮LC：将正常成人包皮消化后得到表皮细胞混悬液，联合采用密度梯度离心和免疫磁珠法分离纯化人表皮LC，将分选后的细胞用结合有FITC的鼠抗人CD1a单抗标记，经流式细胞仪检测LC的纯化率，采用0.4﹪台盼蓝染色检测细胞活性。 2.UVB诱导LC凋亡及EGCG抗凋亡作用研究：用上述方法分离纯化后的LC分为非照光对照组、照光组和EGCG处理组。非照光对照组不接受30mJ/cm2UVB辐射，照光组接受30mJ/cm2UVB辐射，EGCG处理组的处理：接受30mJ/cm2UVB辐射后，加入200μg/mlEGCG，37℃,5﹪CO2培养4小时后PI染色测定细胞凋亡率，并做统计分析。 3.中波紫外线辐射后LC及EGCG处理辐射后LC的细胞周期分析：分离及分组处理方法同前。37℃，5﹪CO2培养4小时后PI染色测定细胞周期，分析各期细胞相对比例，并做统计分析。 4.UVB辐射LC后p53蛋白水平变化的研究：分离及分组处理方法同前。37℃,5﹪CO2培养4小时后提取总蛋白，WesternBlotting法测定p53蛋白含量，观察条带，凝胶成像系统扫描处理。 5.UVB辐射LC后磷酸化p53蛋白水平变化的研究：分离及分组处理方法同前。37℃，5﹪CO2培养4小时后提取总蛋白，WesternBlotting法测定磷酸化p53蛋白含量，观察条带，凝胶成像系统扫描处理。并与p53蛋白比较其变化差异。 6.UVB辐射LC后Bcl-2蛋白水平变化的研究：分离及分组处理方法同前。37℃,5﹪CO2培养4小时后提取总蛋白，WesternBlotting法测定Bcl-2蛋白含量，观察条带，凝胶成像系统扫描处理。 结果1.联合采用密度梯度离心和免疫磁珠的方法分离纯化人表皮LC后，经流式细胞仪检测LC的纯化率为84.48﹪±7.96﹪，台盼蓝染色显示细胞活性为96.9﹪±0.7﹪。 2.空白对照组无明显凋亡峰，细胞凋亡率为1.995﹪±0.070﹪，接受30mJ/cm2UVB辐射组凋亡率为7.450﹪±0.113﹪，EGCG处理组凋亡率为3.565﹪±1.336﹪，经统计学比较差异具有统计学意义(p＜0.05)。提示接受30mJ/cm2UVB辐射后细胞凋亡率高于对照组和EGCG处理组。 3.与未辐射UVB对照组相比，接受30mJ/cm2UVB辐射LCS期细胞数明显增加，几乎没有G2/M期细胞。而EGCG处理组S期细胞数明显减少，G2/M期细胞数略有增加。 4.接受不同剂量(0、30、60、90mJ/cm2)UVB照射后4h各组细胞及加入EGCG细胞的p53蛋白光密度值与GAPDH光密度比值依次为1.073±0.077，1.022±0.021，1.041±0.021，1.060±0.019，1.055±0.068各组与0mJ/cm2组相比，差异无明显统计学意义(p＞0.05) 5.接受不同剂量(0、30、60、90mJ/cm2)UVB照射后4h各组细胞及加入EGCG细胞的ser15磷酸化p53光密度值与GAPDH光密度比值依次为0±0，0.789±0.019，0.907±0.010，0.956±0.017，0.487±0.032各组与0mJ/cm2组相比，差异均有统计学意义(p＜0.05)不同剂量(0、30、60、90mJ/cm2)UVB照射4小时后，磷酸化p53蛋白表达随剂量增加而分别上升14.90﹪和5.44﹪。加入EGCG后磷酸化p53蛋白有所下降，但仍不能恢复至正常。 6.接受不同剂量(0、30、60、90mJ/cm2)UVB照射后4h各组细胞Bcl-2蛋白光密度值与GAPDH光密度比值依次为0.835±0.052，0.686±0.033，0.562±0.025，0.389±0.088，0.726±0.043各组与0mJ/cm2组相比，差异均有统计学意义(p＜0.05)不同剂量(0、30、60、90mJ/cm2)UVB照射4小时后，Bcl-2蛋白表达随剂量增加而分别下降17.84﹪，32.69﹪和53.41﹪。加入EGCG后Bcl-2蛋白下降程度有所减轻，但不能恢复至正常。 结论紫外线可显著诱导分离纯化的人表皮LC凋亡，这可能是机体抵抗紫外线损伤，主动清除损伤或突变细胞的表现之一。对UVB辐射后的LC加入EGCG凋亡率有所下降3.5650﹪±1.3364﹪，表明EGCG有良好的抗凋亡作用。但EGCG的抗凋亡作用是有限的。 对细胞周期进行分析：经30mJ/cm2UVB辐射后，LCS期增多，细胞群被阻滞在S期，推测中波紫外线抑制了细胞DNA合成，将增殖态细胞阻滞于S期，进而诱导了细胞凋亡。UVB辐射后细胞加入EGCG，G0/G1期细胞及G2/M期细胞均有增加而S期细胞显著减少，细胞顺利通过S期，推测与EGCG促进DNA修复合成，进而促进细胞增殖有关。同时G0/G1期细胞及G2/M期细胞的增加可能为S期细胞减少而相对性增加所致。 对凋亡下游信号传导通路研究：在未应激的状态下，LC中p53蛋白主要以非磷酸化的无活性形式存在。UVB辐射后，磷酸化p53蛋白水平明显升高，提示其为UVB辐射细胞后细胞调控信号通路上的重要因子。推测UVB辐射后LC的凋亡率增加及S期阻滞，可能是通过活化细胞内p53蛋白发生ser15磷酸化而发挥下游作用。Bcl-2蛋白为磷酸化p53蛋白激活细胞凋亡通路上的下游蛋白。它主要发挥了抗凋亡的作用。Bcl-2蛋白随UVB辐射剂量的加大而下降，佐证了磷酸化p53蛋白在抗凋亡通路上的作用。而EGCG抗UVB损伤的机制可能与此通路相关并且首先发生在蛋白质活性调节水平上。

目录

全文技术流程图

全文主要缩略语

第一部分 联用密度梯度离心与免疫磁珠法分离纯化人表皮LC

第二部分:EGCG减轻中波紫外线诱导的Langerhans细胞凋亡作用的研究

第三部分表皮LC中波紫外线照射后及加入EGCG后p53蛋白磷酸化水平和下游蛋白Bcl-2变化的研究

全文小结

参考文献

致谢

附综述和已发表文章1

附综述和已发表文章2

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