芯片技术用于肺癌患者APC基因启动子1A多位点甲基化定量检测

摘要

背景：肺癌由于缺乏有效的早期诊断方法，即使在发达国家，5年生存率也低于15﹪。高甲基化是导致抑癌基因失活的重要机制，现已证实，启动子区高甲基化导致抑癌基因失活是人类肺癌的共同特征。APC是一种抑癌基因，其启动子区高甲基化与多种肿瘤的发生相关。研究显示，肺癌患者APC基因启动子区存在较高的甲基化。因此推断，检测APC启动子区甲基化，对于肺癌的早期诊断可能具有重要意义。目前最常用的甲基化检测技术，如亚硫酸氢钠/测序法、甲基化特异性PCR、原位-MSP杂交、单链核苷酸引物延伸法、变性高效液相色谱法等都无法对多位点进行甲基化定量检测，甲基化定量检测芯片的出现解决了这一难题。 目的：建立抑癌基因APC启动子1A的甲基化定量芯片检测方法，对肺癌患者及正常人的临床标本进行检测，探讨肺癌患者APC基因的甲基化模式及甲基化杂合型状态。 方法：选取一段420bp的APC基因启动子1A部位中CpG密集序列作为靶序列，针对687、707、714、719和726共5个CpG靶位点，设计一套检测甲基化与非甲基化的探针。经过玻片的清洗及硅烷化、手臂分子的联接、探针的点样及固定等多个步骤制备甲基化芯片。将人脐带血经过DNA提取、转甲基、亚硫酸盐修饰、质粒克隆重组等步骤后建立阳性、阴性质控品，按照质量百分比0﹪、25﹪、50﹪、75﹪、100﹪混合后，检测分析，建立了甲基化定量检测荧光强度标准曲线，并且确定了非甲基化与杂合型的甲基化率检测范围。提取2例正常人的外周血淋巴细胞DNA、14例正常人的肺组织DNA、28例肺癌患者的56份肿瘤和正常肺组织DNA，进行亚硫酸盐化学修饰，以甲基化特异性引物进行基因扩增后，与探针杂交，定量检测分析，并同时将PCR产物进行甲基化特异性序列分析。实验结果用统计软件SPSS10.5四格表法分析。 结果：甲基化阴性、阳性质控品的芯片检测与测序结果吻合。五个位点的荧光强度标准曲线的R2介于0.93～0.99之间。687、707、714、719和726共5个位点非甲基化的检测范围分别是：0﹪±8.7﹪、0﹪±17.6﹪、0﹪±17﹪、0﹪±13﹪、0﹪±8﹪；甲基化杂合型的检测范围分别是：50﹪±3.6﹪、50﹪±6.9﹪、50﹪±3.5﹪、50﹪±8.5﹪、50﹪±7.3﹪。687、707、714、719和726共5个CpG位点的甲基化率与杂合型及其范围以上的甲基化发生率从低到高依次是，正常人、肺癌患者的正常肺组织、肺癌患者的肿瘤组织。正常人与肺癌患者的正常肺组织和肿瘤组织707、714、719和726共4个CpG位点的甲基化率差异均有显著性；肺癌患者的肿瘤与肺癌患者的正常肺组织5个CpG位点的甲基化率与杂合型及其范围以上的甲基化发生率差异均无显著性；正常人与肺癌患者正常肺组织707、714位点的杂合型及其范围以上的甲基化发生率有显著性差异；正常人与肺癌患者肿瘤组织707、714、719、726共4个位点的杂合型及其范围以上的甲基化发生率有显著性差异。肺癌患者5个位点的甲基化率与杂合型及其范围以上的甲基化发生率是，位点687最低，707、714最高。肺癌患者正常肺组织位点687与位点707、714之间的甲基化率有显著性差异；肺癌患者肿瘤组织位点687与位点707、714、719、726之间的甲基化率有显著性差异；肺癌患者位点687与707、714之间的杂合型及其范围以上的甲基化发生率有显著性差异。肺癌患者中存在甲基化杂合型状态，结果与测序结果一致。 结论：本研究建立了APC基因启动子1A区5个CpG位点的甲基化定量检测芯片，实现了对多位点甲基化的定量检测。本研究以甲基化芯片技术对肺癌标本进行了定量检测分析(国内外尚未见报道)，证实了肺癌中存在APC基因甲基化模式及甲基化杂合型，这些可能对肺癌的早期诊断有着重要的意义。

目录

中英文缩略词语表

前言

第一部分APC基因甲基化定量检测芯片的建立

第二部分APC基因甲基化定量检测芯片在肿瘤中的初步应用

小结

参考文献

致谢

论文

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