ATP敏感性钾通道开放剂埃他卡林对谷氨酸诱导PC12细胞损伤的保护作用

摘要

谷氨酸(glutamate，Glu)是中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)中重要的兴奋性神经递质，参与生理及病理过程的调节。适量的Glu对于维持细胞的正常生理活动是必需的，但胞外Glu浓度过高则会产生毒性，导致神经元损伤。自1957年首次发现Glu长时间作用能够引起神经元损伤到1969年提出其毒性学说，人们对Glu兴奋性毒性的认识逐渐加深。Glu兴奋性毒性(excitotoxicity)是指胞外Glu释放过多或摄取被抑制，导致突触间隙中Glu浓度急剧升高，过度激活N-methyl-D-aspartate(NMDA)受体，引起钙离子的大量内流，细胞内钙超载，最终导致神经元的损伤或凋亡。因此，抑制突触前Glu的过度释放或抑制突触后Glu介导的兴奋性毒性，是神经保护的重要策略。 ATP敏感性钾离子通道(ATP-sensitivepotassiumchannels,KATP)是一类由胞内ATP/ADP水平调控、非电压依赖性的、直接耦联细胞代谢和电活动的特殊钾离子通道，包括本实验室在内的研究已经表明，KATP是包括PD在内的许多神经退行性疾病神经保护治疗的新靶标。埃他卡林(iptakalim，IPT)是以KATP为靶标、由我国学者自行设计和合成的一个脂肪仲胺类小分子化合物，具有易透过血脑屏障的独特优势。本实验室的前期研究发现IPT对多种神经毒素导致的在体或离体细胞损伤均具有保护作用。 本文以PC12细胞为研究对象，首先鉴定了PC12细胞KATP亚基的组成，为IPT作用靶点的确定奠定基础；建立Glu兴奋性毒性损伤模型，研究不同浓度IPT对Glu损伤的保护作用及其对高钾诱导PC12细胞Glu释放的影响，探讨IPT对Glu诱导的兴奋性毒性的保护作用及相关机制，为IPT发展成为具有自主知识产权的神经保护治疗新药积累必要的实验支持。 目的：鉴定PC12细胞上KATP亚基组成，探讨IPT对Glu致PC12细胞损伤的保护作用及其相关机制研究。 方法：1)RT-PCR法在mRNA水平、Westernblotting和免疫荧光法在蛋白水平分别鉴定PC12细胞的KATP亚基组成；2)MTT法测定细胞活力；流式细胞仪检测细胞凋亡。实验分组如下：①对照组；②Glu处理组：1、5、10、15、20mM；③10mMGlu+10μMIPT；④10mMGlu+10μMpinacidil；⑤10mMGlu+10μMIPT+10μMglibenclamide；⑥10mMGlu+10μMpinacidil+10μMglibenclamide；3)荧光探针法测定PC12细胞内钙离子(calcium，Ca2+)浓度；高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)和荧光法联合检测细胞外液中Glu的浓度。 结果：1)利用RT-PCR、免疫荧光和Westernblotting方法鉴定发现，PC12细胞表达KATP，其亚基组成为Kir6.1和SUR2；2)Glu能够浓度依赖性(1、5、10、15和20mM)降低PC12细胞活力，Glu在10mM能够将细胞活力降至73﹪，选择该浓度作为造模浓度。10μMIPT能够显著抑制Glu所致的PCI2细胞活力降低和凋亡，该作用可被glibenclamide所逆转；3)10μMIPT能够显著抑制10mMGlu诱导的胞内Ca2+浓度升高，该作用能够被glibenclamide完全取消。IPT能够浓度依赖性(0.01、0.1、1、10和100μM)的抑制高钾(80mMKCl)所致PC12细胞释放Glu的增多，且该作用能够被glibenclamide阻断。 结论：PC12细胞表达KATP，其亚基组成为Kir6.1、SUR2A/2B。IPT通过开放PC12细胞上的KATP发挥对PC12细胞的保护作用，其作用机制与抑制Glu释放和拮抗胞内Ca2+浓度升高有关。

目录

英文缩略词表

前言

材料与方法

结果

讨论

结语

参考文献

附录在读期间发表或已完成的论文

综述 细胞凋亡与帕金森病

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