粘细菌分子伴侣/引领蛋白样通路上有调控信号的筛选及功能分析

摘要

目的:
　　分子伴侣/引领蛋白(Chaperone/usher,CU)通路是目前为止最普遍最具有代表性的菌毛装配途径，CU通路包括经典型、交替型和远古型三大家族，其中远古型CU通路分布最广，存在于许多重要的致病微生物和环境微生物。黄色粘球菌（M.Xanthus)是研究原核生物发育分化的良好模型，其Mx3885-3882基因簇编码远古型CU样通路，Mx3883属引领蛋白家族，Mx3884属细胞周质分子伴侣家族，二者与孢子外壳蛋白基因Mx3885共转录，Mx3885-3883组成操纵子，其表达受发育调控。本论文拟筛选粘细菌CU样通路上游调控信号，并对该调控信号的作用机制进行初步分析。这一工作既可以发现、鉴定粘细菌发育调节网络新组分，揭示该模式生物细胞分化路径，同时也有助于解析其它革兰氏阴性菌CU通路上游调节信号。为阻断细胞表面黏附性致病因子的合成提供新思路。
　　方法:
　　将转座子mariner通过电穿孔随机插入到Mx3883-1acZ转录融合菌株中，在营养缺陷平板依据蓝白斑筛选上游调控信号;对筛选出的突变株中转座子插入位点进行定位;利用lacZ检测候选信号分子在发育阶段的时间表达谱;通过基因敲除明确候选信号分子是否为调控CU样操纵子的信号分子;观察候选信号分子敲除后粘细菌子实体形态发生和细胞分化有无异常;检测C信号通路是否影响CU样操纵子表达;在大肠杆菌表达纯化上游信号分子，初步分析其生化特性。
　　结果:
　　1.通过遗传学方法筛选出一株影响Mx3885-3883在发育阶段表达的突变株，Western验证结果显示在该转座子插入突变株中检测不到Mx3885蛋白的表达。
　　2.通过基因克隆和测序明确转座子mariner插入到黄色粘球菌Mx2872基因位点。
　　3.报告基因检测显示，Mx2872在粘细菌发育后15h开始表达，48h表达最高，72h后逐渐下降。这与Mx3885-3883操纵子表达时序有差别。
　　4.成功构建Mx2872敲除菌株(△Mx2872)。Western结果显示，ΔMx2872菌株发育24h检测不到Mx3885蛋白的存在，但在48h后可以检测到Mx3885蛋白。ΔMx2872菌株子实体发育滞后且细胞分化受到影响。
　　5.Western检测结果显示C信号阻断菌株中基本检测不到Mx3885蛋白的表达。
　　6.生物信息分析提示Mx2872蛋白属于单加氧酶-黄素结合蛋白家族。从大肠杆菌可溶性蛋白中纯化出Mx2872蛋白紫外可见吸收光谱结果分析表明Mx2872蛋白为黄素结合蛋白家族。
　　结论:
　　1.通过遗传学方法筛选到一个影响粘细菌CU样通路表达的上游调控因子Mx2872。
　　2.Mx2872在粘细菌发育时期特异表达。
　　3.Mx2872参与黄色粘球菌子实体的形成，敲除Mx2872导致细胞聚集延迟。
　　4.Mx2872蛋白属于黄素结合蛋白家族。Mx2872是Mx3885-3883操纵子上游调控信号之一。
　　5.粘细菌CU样通路表达依赖C信号通路。

目录

声明

摘要

前言

文献综述 分子伴侣／引领蛋白(CU)通路蛋白分泌机制及其调控

第一章 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

第二章 实验结果

2．1 粘细菌CU样通路上游调控信号的筛选

2．1．1 粘细菌CU样通路上游调控信号x的筛选

2．1．2 定位转座子插入粘细菌基因组中的位点

2．2 Mx2872蛋白在粘细菌发育进程中的功能分析

2．2．1 Mx2872基因表达的检测

2．2．2 敲除Mx2872基因

2．2．3 Mx2872敲除后的生物学功能分析

2．2．4 Mx2872位点基因组织结构的确定

2．2．5 纯化并检测Mx2872蛋白

2．2．6 C信号通路是否影响CU样操纵子表达

第三章 讨论

3．1 粘细菌CU样通路上游调控信号筛选

3．2 Mx2872蛋白在粘细菌发育进程中的功能分析

第四章 小结

致谢

参考文献

作者简介