逆转录病毒载体介导Fcy∷Fur融合基因联合5-FC对胶质瘤细胞C6杀伤作用的体内外研究

摘要

本研究的目的是为了研究融合型自杀基因Fcy：：Fur联合5-FC对胶质瘤细胞C6的杀伤作用。根据逆转录病毒表达载体pLXSN的多克隆位点及质粒pORF5-Fcy：：Fur上Fcy：：Fur的基因序列，设计PCR引物，在引物的5’端分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，采用常规PCR从pORF5-Fcy：：Fur中扩增出Fcy：：Fur融合基因，经核酸序列测定正确后，分别克隆进pLXSN。经双酶切鉴定无误后，转染包装细胞PT67，扩大培养阳性克隆并收集上清，获得重组逆转录病毒。重组病毒感染靶细胞C6，以G418筛选得到稳定表达Fcy：：Fur的阳性细胞株，并经抽提细胞基因组DNA和RNA分别进行PCR和RT-PCR等鉴定目的基因的整合。在稳定表达Fcy：：Fur的C6细胞中加入5-FC，MTT法测定肿瘤细胞杀伤效应并计算细胞生长抑制率、免疫组化检测凋亡相关蛋白Fas及Bcl-2的表达、流式细胞仪检测细胞凋亡比例及电镜观察等方面来研究对肿瘤细胞杀伤情况。裸鼠皮下移植C6-Fcy：：Fur、C6-PLXSN及C6细胞后腹腔注射5-FC或PBS液，比较裸鼠生存期及肿瘤大小，并观察流式细胞仪检测结果及电镜下表现。结果显示：融合型自杀基因Fcy：：Fur联合5-FC在体内外可对胶质瘤细胞C6产生明显的杀伤作用，与对照组相比，细胞增殖明显受抑制；电镜下可观察到凋亡小体；流式细胞仪检测实验组细胞凋亡率明显大于对照组，提示细胞凋亡可能参与了杀伤机制。免疫组化发现5-FC加入后，发生了Fas、Bcl-2表达的下调，提示Fas及Bcl-2可能参与Fcy：：Fur诱导的凋亡。裸鼠移植瘤与对照组相比，裸鼠生存期明显延长，肿瘤明显减小。

目录

摘要

前言

第一部分含Fcy：：Fur融合基因的逆转录病毒载体的构建及对C6细胞的转染

第二部分5-FC对稳定表达Fcy：：Fur的C6细胞株杀伤作用的初步研究

第三部分5-FC对接种C6-Fcy：：Fur细胞的裸鼠的治疗作用

结语

参考文献

附录 攻读硕士学位期间公开发表的学术论文

致谢

综述胶质瘤的自杀基因治疗

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