shRNA/胍基化阳离子聚合物复合物的制备与基因沉默研究

摘要

高效低毒的基因载体是将治疗基因(shRNA或siRNA)递送到靶组织或靶细胞，发挥稳定基因治疗作用的关键。阳离子聚合物基因载体具有制备简单，无免疫原性，结构易于修饰等优点。 论文基于3-胍丙基甲基丙烯酰胺(GPMA)结构，构建了靶向性、抗聚集功能的胍基共聚物阳离子载体，并考察了共聚物/shRNA复合物的细胞毒性、摄取能力和转染效率，针对hTERT与Survivin基因，探索了shRNA基因沉默效果。 首先，通过在线siRNA设计软件设计了针对hTERT与Survivin基因的siRNA序列，构建了含有hTERT与Survivin基因mRNA序列的shRNA，并将shRNA插入含有绿色荧光报告基因(GFP)的质粒载体，得到了能表达hTERT和Survivin siRNA的重组质粒shRNA，经菌落PCR实验结果和测序结果证实了shRNA序列完整正确。 论文第三章通过链转移自由基聚合法(RAFT)制备了系列3-葡萄糖酰胺丙基甲基丙烯酰胺-st-3-氨丙基甲基丙烯酰胺共聚物共聚物(GAPMA-st-APMA，GA)，并进一步胍基化得到3-葡萄糖酰胺丙基甲基丙烯酰胺-st-3-胍丙基甲基丙烯酰胺共聚物(GPMA-st-GAPMA，GGA)。凝胶电泳和动态光散射实验结果表明，GGA/shRNA复合物的完全复合电荷比为0.5，平均粒径在150-350 nm左右。人肝癌细胞（HepG2）毒性和沉默试验结果表明，GGA/shRNA复合物相比GA/shRNA复合物有更佳的hTERT基因沉默效果。血清存在条件下，GGA3/shRNA复合物依然可以有效沉默hTERT mRNA(P＜0.05)。可以推测，含糖链段具有较好的亲水性和抗聚集作用，带正电性胍基具有促进细胞膜穿透功能。 第四章采用RAFT聚合法制备了半乳糖化2-羟丙基甲基丙烯酰胺-st-3-胍丙基甲基丙烯酰胺共聚物（Galactosylated HPMA-st-GPMA，GGH）。GGH/shRNA复合物的细胞毒性实验结果表明，复合物对肝癌细胞（HepG2）和宫颈癌细胞(HeLa)的毒性均低于PEI。GPMA链段含量为57.32％的GGH3在HepG2细胞转染试验中表现出高转染效率，推测GGH上的半乳糖基团有效介导了肝肿瘤细胞表面去唾液酸糖蛋白(ASGP)受体调节的转染过程。另外在有血清条件下，HPMA链段有效掩蔽了GGH/shRNA复合物表面的正电荷，降低了复合物与血清蛋白的聚集。 最后，制备了系列聚乙二醇甲基丙烯酸酯-st-3-胍丙基甲基丙烯酰胺共聚物(PEGMA-st-GPMA，GP)，随后接枝半乳糖基团，，得到半乳糖化聚乙二醇甲基丙烯酸酯-st-3-胍丙基甲基丙烯酰胺共聚物(Galactosylated PEGMA-st-GPMA，GGP)。粒径和Zeta电位实验结果表明，GGP/shRNA复合物在电荷比为8时平均粒径在160nm，呈正电性。转染实验结果表明， GGP/shRNA复合物在有、无血清存在的条件下均实现较佳的细胞转染和基因沉默效率。其中，GGP2/shRNA复合物显示出最佳的Survivin mRNA沉默效率。可以推测胍基和半乳糖功能团的引入显著增强较低电荷比下复合物的转染效率。模拟体内条件下的转染实验结果表明，含有48.6％亲水链段(PEGMA)的GGP2/shRNA复合物可以显著沉默Surivin mRNA(P＜0.01)。以此推测，PEG链段的引入减少了复合物与血清中蛋白的结合，提高了复合物沉默Survivin mRNA的效率。体内动物实验表明，GGP2/shRNA复合物有效抑制HepG2肿瘤的生长(P＜0.01)，降低Survivin蛋白的表达，以此推测Survivin shRNA促使肿瘤细胞启动了凋亡通路，减缓肿瘤组织的生长。 本论文制备的共聚物载体结合了半乳糖基团的靶向作用，胍基基团对基因的压缩和对细胞膜穿透能力，并利用HPMA、GAPMA和PEGMA链段的亲水作用，获得具有低毒性和良好转染效率的基因载体，体现了其在基因治疗领域有潜在应用价值。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 绪论

1．1 基因治疗

1．2 阳离子高分子基因递送系统

1．3 阳离子高分子基因载体的合成方法——活性／可控自由基聚合法

1．4 阳离子聚合物基因载体的结构修饰方法

1．5 阳离子聚合物载体／shRNA复合物的形成、体内递送障碍和解决方法

1．6 论文主要研究方案

1．7 论文的创新点

第二章 表达人TERT基因与表达人Survivin基因的短发卡状小干扰RNA质粒载体的构建和扩增

2．1 引言

2．2 实验部分

2．3 结果与讨论

2．4 小结

第三章 3-葡萄糖酰胺丙基甲基丙烯酰胺-st-3-胍丙基甲基丙烯酰胺共聚物(GAPMA-st-GPMA)基因递送载体用于体外沉默hTERT基因的研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．3 结果与讨论

3．4 小结

第四章 半乳糖化2-羟丙基甲基丙烯酰胺-st-3-胍丙基甲基丙烯酰胺共聚物(Galactosylated HPMA-st-GPMA)基因递送载体用于体外沉默hTERT基因的研究

4．1 引言

4．2 实验部分

4．3 结果与讨论

4．4 小结

第五章 半乳糖化聚乙二醇甲基丙烯酸酯-st-3-胍丙基甲基丙烯酰胺共聚物(GalactosylatedPEGMA-st-GPMA)基因递送载体用于体内外沉默Survivin基因研究

5．1 引言

5．2 实验部分

5．3 结果与讨论

5．4 小结

第六章 全文总结与展望

6．1 全文总结

6．2 展望

参考文献

致谢

附录 攻读博士学位期间所发表的学术论文