慢病毒介导的转录因子基因改善阿尔茨海默病小鼠模型神经认知功能的实验研究

摘要

研究背景和目的: 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种发生于老年前期或老年期的中枢神经系统退行性病变，主要以进行性的记忆认知功能障碍、人格性格改变为特征，其主要病理特征为老年斑形成(senile plaques，SP)、神经原纤维缠结沉积(neurofibrillary tangles，NFTs)、海马锥体细胞颗粒空泡变性以及神经元缺失等。伴随着社会老龄化进程日益增快，AD的发病率逐年升高，当前已经成为严重的社会问题。然而，迄今为止AD的发病原因以及发病机制仍未明确。大量研究证据证实进行性神经元脱失和脑内神经炎症在AD病理过程中起到核心作用。目前，临床上仍然缺乏治疗AD的有效手段。因而，寻找有效可行的AD治疗方法，具有重要的医学意义和社会意义，是神经病学领域研究亟需解决的关键问题，也是每一位神经科学工作者面临的巨大挑战。近年来，伴随着分子生物学以及医学生物工程的高速发展，基因治疗为人类防治AD带来了希望。 本实验采用C57BL/6小鼠作为研究对象，采用Aβ1-42双侧海马直接注射建立AD动物模型，用两个剂量滴度的慢病毒介导的三种转录因子组合(Ascl1-Brn2-Pax6)进行干预治疗。观察慢病毒介导的三种转录因子组合对Aβ1-42海马注射小鼠学习记忆能力及海马神经损伤的影响，进一步探讨慢病毒介导的三种转录因子治疗改善AD小鼠学习记忆能力的作用机制，以寻求预防和治疗AD新的途径和方法。 研究方法: 本研究共选用40只C57BL/6小鼠，并随机分为4组，分别为假手术组，AD模型组(Aβ1-42造模组)，低滴度病毒治疗组（病毒滴度为1.0×109TU/ml）和高低度病毒治疗组（病毒滴度为1.5×109TU/ml），每组10只。本实验采用小鼠双侧海马立体定向注射Aβ1-42的方法建立AD小鼠模型;造模前3天将两种滴度剂量慢病毒介导的三种转录因子ABP混合液体分别注入对应实验组的小鼠双侧海马中（假手术组用同体积的生理盐水代替），然后在造模后一周即治疗后10天对实验小鼠进行水迷宫实验，观察各组小鼠学习记忆能力。水迷宫实验结束后取小鼠脑组织制作石蜡切片，通过HE染色方法观察小鼠海马组织形态学的改变，此外，利用组织蛋白芯片筛选各组实验小鼠海马组织中蛋白表达水平变化，探讨AD小鼠学习记忆能力下降的原因以及治疗过程中可能的蛋白水平机制。 研究结果: 水迷宫实验结果显示，相比于假手术组小鼠，AD模型组小鼠逃避潜伏期明显延长(P＜0.05)，目标象限游泳时间占游泳总时间百分比以及穿越平台次数显著减少(P＜0.05)。而与模型组小鼠相比较，高病毒或者低病毒介导的ABP基因治疗组的小鼠逃避潜伏期缩短，在目标象限游泳时间占总时间百分比以及穿越平台的次数明显增多，且结果具有统计学差异，提示慢病毒介导三种转录因子ABP治疗可显著改善Aβ1-42诱导的AD小鼠空间辨别学习记忆障碍。 HE染色显示假手术组小鼠海马齿状回(DG)和海马CA3区神经细胞排列紧密，细胞层次多，染色分布均匀，细胞核大而圆，核仁清楚可辨。AD模型组海马DG区和CA3区神经细胞排列相对较稀疏，细胞层次也明显减少，部分细胞核空泡样改变，镜下可见细胞核深染、核固缩，核仁偏移。低剂量和高剂量基因慢病毒载体治疗组海马DG区以及CA3神经细胞与模型组相比较，细胞呈圆形或者椭圆形，神经细胞排列整齐紧密，细胞脱失情况相对较少，核仁较清晰。 蛋白芯片结果显示，与假手术组小鼠相比，AD模型组小鼠海马组织中有8种蛋白水平表达水平具有明显的差异。而与模型组小鼠相比较，高病毒或者低病毒介导的ABP基因治疗组的小鼠海马组织中其中一些蛋白表达水平也明显改变。其中大部分蛋白质为神经再生、神经营养作用相关功能蛋白以及一些炎症相关蛋白因子。在这些差异表达的蛋白因子中，有10种(VEGF，FGF2，IL-3，HGF，IL-4，IL-5，SDF-1α，TIMP-1，TIMP-2，Chordin)表达水平明显升高达;有4种蛋白因子(CD40，TNFα，IL-17，CD27 Ligand)表达明显降低。 研究结论: (1)实验研究结果显示通过双侧海马内立体定向注射Aβ1-42建立的AD模型小鼠出现了AD的一些特征性行为学及组织病理改变，说明AD小鼠模型造模是成功的。 (2) Morris水迷宫实验提示AD模型小鼠学习记忆能力明显降低，慢病毒介导三种转录因子ABP治疗后可明显改AD小鼠的学习记忆能力。 (3)慢病毒介导三种转录因子治疗能明显减轻AD小鼠海马齿状回和CA3区神经元丢失现象，说明三种转录因子治疗对AD小鼠海马齿状回和CA3区神经元具有保护作用。 (4)慢病毒介导三种转录因子治疗改善Aβ1-42诱导的AD小鼠的空间学习记忆能力的作用可能与其保护海马神经元、促进神经元再生、抗神经细胞凋亡以及抗神经炎症等机制相关。

目录

声明

主要缩略词中英文对照

摘要

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

结果

一、动物模型结果

二、Morris水迷宫实验结果

三、海马HE染色结果

四、蛋白芯片检测海马组织蛋白差异性表达结果

讨论

一、Aβ导致AD空间学习记忆能力障碍的毒性机制

二、Aβ1-42双侧海马注射制备AD小鼠模型以及模型评价

三、Morris水迷宫实验

四、慢病毒介导的三种转录因子基因治疗改善AD小鼠学习记忆能力及其可能机制

结论

参考文献

综述 阿尔茨海默病的基因治疗进展

硕士研究生期间研究成果及奖励

致谢