长非编码RNA ANRIL下调KLF2的表达促进肝癌细胞增殖的机制研究

摘要

肝细胞癌（以下简称为肝癌）为肝癌的主要病理类型，其死亡率位居我国恶性肿瘤死因第二位，是严重影响我国居民健康的恶性疾病。关于其发病的分子机制，仍未完全阐明，研究表明众多lncRNAs在多种肿瘤包括肝癌中表达异常，且与肿瘤细胞的增殖、细胞周期进程改变、凋亡、以及侵袭迁移等生物学行为密切相关，参与肿瘤的发生发展过程。
　　lncRNA ANRIL(antisense noncoding RNA in the INK4 Locus)定位于9q21染色体上，是细胞周期激酶抑制子4b(INK4b)位点的反义非编码RNA，它通过调节INK4b-ARF-INK4a抑制p15INK4b和p16INK4a等抑癌因子和激活Ras通路从而延缓细胞衰老以及促进肿瘤发生及发展。研究表明ANRIL与胃癌、食管癌等肿瘤的发生及发展密切相关，但其在肝癌中的表达情况及其具体的生物学功能尚不清楚，需进一步研究。
　　本课题中，我们通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测77例肝癌患者癌组织及癌旁组织中ANRIL的表达水平，发现其表达水平在肝癌组织中较癌旁组织显著上调(P＜0.01)，结合临床病理资料分析发现，ANRIL的表达水平与肝癌患者的肿瘤大小(P＜0.01)、BCLC分期（P＜0.01)密切相关，进一步的研究发现，ANRIL在肝癌细胞系（HepG2，Hep3B，MHCC-97H）中的表达较肝正常细胞系(L02)显著上调(P＜0.01);MTT、克隆形成、transwell实验、流式细胞术检测发现肝癌细胞中干扰ANRIL能抑制细胞增殖、侵袭转移能力，并诱导细胞凋亡;定量PCR及Western blotting结果显示KLF2 mRNA及蛋白的表达在干扰ANRIL后显著上调;核质分离实验发现ANRIL亚细胞定位主要位于核内，RIP实验结果证实ANRIL可以与SUZ12及EZH2结合，ChIP实验证实EZH2及SUZ12可与KLF2启动子区结合，提示KLF2可能是ANRIL下游的重要靶基因;进一步干扰EZH2和SUZ12后KLF2表达水平显著上调;过表达KLF2后发现肝癌细胞增殖及克隆形成能力明显下降，并能阻滞肝癌细胞周期进程于G1期，同时也能明显的促进肝癌细胞的凋亡;生物信息学分析发现ANRIL可能受到SP1调控，过表达及干扰SP1表达后ANRIL表达量随之改变，ChIP实验进一步证实SP1可与ANRIL的启动子区结合。
　　综上所述，本研究提示:肝癌中SP1促进ANRIL的转录，并通过绑定PRC2复合物介导KIF2启动子区的组蛋白H3K27三甲基化抑制其转录，促进肝癌细胞恶性增殖。本研究为丰富肝癌发生机制提供依据，有可能为肝癌治疗提供新的靶点。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 ANRIL在肝癌组织中表达及其与患者临床病理特征的关系研究

一、材料和方法

二、结果与分析

三、讨论

第二部分 探讨ANRIL对肝癌细胞生物学行为的影响

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第三部分 ANRIL调控KLF2表达促进肝癌细胞恶性增殖的机制研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第四部分 SP1调控ANRIL的机制研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

本文结论

展望

参考文献

附表

综述 长链非编码RNA与肝癌的研究进展

学习期间发表论文情况

致谢