MiR-709下调GPC5表达促进肝癌细胞增殖、侵袭和转移的机制研究

摘要

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下简称肝癌）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率分居全球恶性肿瘤的第5位和第3位。肝癌发病隐匿，早期诊断困难，预后差且极易转移复发，这也严重影响了肝癌的治疗效果。肝癌发生发展及转移复发的分子机制复杂且尚未完全清楚。MiRNA是近年来在真核生物体内发现的一种非编码的单链小分子RNA，miRNA高度保守，在体内主要起转录后负调控作用。研究已证实miRNA在肝癌的发生发展过程中起着重要作用。MiR-709在多种器官组织如脑、淋巴结、心脏、肺、肝脏和肾脏中含量丰富。MiR-709在肝癌中的作用还未见报道。因此，miR-709在肝癌的发生发展过程中的功能作用及其机制值得我们深入去研究。
　　目的：探究miR-709在HCC发生发展过程中的作用。
　　方法：运用qRT-PCR检测肝细胞、肝癌细胞、肝癌组织及癌旁正常组织检测miR-709水平，分析miR-709与肝癌临床病理特征间关系。将miR-709 mimic和miR-709 inhibitor转染到肝癌细胞中，检测miR-709的表达，分别采用CCK-8增殖实验、Transwell迁移实验和western blot实验检测转染后肝癌细胞株的增殖、周期、迁移及侵袭能力的变化情况。然后通过运用生物信息学软件进一步检测miR-709的靶基因，然后通过荧光素酶报告基因检测系统、qRT-PCR以及western Blot等方法验证miR-709的作用靶点。
　　结果：
　　（1）①MiR-709在肝癌细胞中表达上调：通过应采用qRT-PCR检测miR-709水平在肝癌细胞（HepG2,SMMC7721、Hep3B和Bel7402)和肝细胞HL-7702间表达水平发现，miR-709在肝癌细胞中表达明显上调；
　　②MiR-709在肝癌组织中表达上调：对6对研究的肝癌组织和其癌旁正常组织中的miR-709进行初步筛查发现肝癌组织中miR-709水平上调表达。然后对纳入的50对肝癌组织及其癌旁正常组织中的miR-709进行检测发现，miR-709在肝癌组织中表达明显上调（P<0.001）。在50例肝癌病人中，有40例（80%）肝癌病人的miR-709在肝癌组织中的水平明显高于其癌旁正常组织。我们研究发现，高表达的miR-709和肝癌的pTNM分期、侵袭及转移呈正相关。
　　（2）①过表达miR-709可促进肝癌细胞增殖：将miR-709 mimic and inhibitor成功转染到肝癌细胞内，运用CCK-8实验检测肝癌细胞增殖发现下调miR-709可抑制肝癌细胞增殖，转染miR-709 mimic可促进肝癌细胞增殖；对Ki-67蛋白及其mRNA水平检测发现转染miR-709 mimic可促使细胞增殖，而转染miR-709 inhibitor则抑制增殖。
　　②过表达miR-709可促进肝癌细胞的转移及侵袭：与转染miR-709 inhibitor肝癌细胞相比，转染miR-709 mimic过表达miR-709可促进肝癌细胞的转移及侵袭。
　　（3）GPC5是miR-709作用的靶基因：通过PicTar和TargetScan生物信息学软件预测发现，miR-709可和GPC53?-UTR互补配对。将野生型和突变型GPC53，UTR克隆植入荧光素酶报告质粒中，分别构建野生型（WT）和突变型（Mut）的荧光素酶报告质粒并与miR-709 mimic和Scramble转染到肝癌细胞中对萤光素酶活性进行检测，以明确miR-709与其靶基因3'UTR间的相互作用。在肝癌细胞HepG2细胞，转染miR-709 mimic对基因GPC5的野生型3'UTR报告基因质粒的萤光素酶的活性有明显的抑制作用（P＜0.001）；但对基因GPC5的突变型3'UTR报告基因质粒的萤光素酶活性没有明显的影响。基因GPC5是miR-709的直接作用的靶基因，miR-709能直接与GPC5的3'UTR靶向结合，发挥抑制其表达的作用。转染miR-709 mimic可以明显抑制HepG2细胞的GPC5蛋白和mRNA的表达。将pcDNA质粒、pcDNA-GPC5质粒、pcDNA-GPC5+miR-709转染HepG2细胞检测对肝癌细胞的增殖和侵袭能力的影响，转染pcDNA-GPC5质粒后的肝癌细胞的增殖和侵袭能力明显减弱，转染pcDNA-GPC5+miR-709质粒后的肝癌细胞的增殖和侵袭能力明显提高。
　　结论：
　　MiR-709在肝癌组织中可上调表达，过表达的miR-709与肝癌的pTNM分期正相关。进一步研究发现 miR-709靶向作用GPC5基因可促使肝癌细胞的增殖、转移及侵袭。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、miR-709在肝癌细胞系和肝癌标本中的表达

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、miR-709对肝癌细胞HepG2的生物学功能

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、miR-709靶基因的预测和鉴定

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:miRNA在肝癌中的研究进展

致谢

个人简历