mir-26b下调EphA2表达抑制原发性肝癌细胞增殖、侵袭和转移的机制研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 microRNA-26b和EphA2在肝癌细胞中的表达
　　目的:
　　本部分主要探讨miR-26b和EphA2在8种肝癌细胞系（HepG2、SMMC7721、bel-7402、PLC、LM3、Huh7、97L和97H）和正常肝细胞L02中的表达情况。
　　方法:
　　1.8种肝癌细胞系（HepG2、SMMC7721、bel-7402、PLC、LM3、Huh7、97L和97H）和正常肝细胞系L02的培养在DMEM培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中培养。
　　2.qRT-PCR分析miR-26b在8种肝癌细胞和正常肝细胞中的表达水平。
　　3.Western blot分析EphA2在8种肝癌细胞和正常肝细胞中的表达水平。
　　结果:
　　1.与正常肝细胞相比，7种肝癌细胞(HepG2、SMMC7721、bel-7402、PLC、LM3、97L和97H)中miR-26b的表达明显下调。
　　2.与正常肝细胞相比，6种肝癌细胞（HepG2、SMMC7721、bel-7402、LM3、97L和97H）中EphA2的表达明显上调。
　　结论:
　　miR-26b在肝癌中可能是一种肿瘤抑制miRNA，而EphA2可能为一种致瘤性基因，miR-26b可能会调控EphA2表达。
　　第二部分 microRNA-26b调控EphA2表达的报告基因验证
　　目的:
　　本部分主要研究肝癌中microRNA-26b与EphA2是否存在靶向调控关系。
　　方法:
　　1.使用生物信息软件www.microRNA.org和TargetScan预测microRNA-26b与EphA2的靶向结合位点。
　　2.miR-26b mimics、miR-26b inhibitor和阴性对照(negative control)购买自RiboBio公司(Guangzhou，Guangdong，China)。构建EphA2突变体。
　　3.采用双荧光素酶报告基因验证microRNA-26b与EphA2之间的靶向关系。
　　结果:
　　1.使用生物信息软件www.microRNA.org和TargetScan预测，microRNA-26b能够靶向结合EphA2。
　　2.通过双荧光素酶报告基因分析，我们的研究发现共转染miR-26b mimics能够明显抑制正常EphA2的荧光活性，但是对突变EphA2的荧光活性无影响。
　　结论:
　　在肝癌细胞中，miR-26b可以直接靶向结合EphA2,证明EphA2可能是miR-26b的一个靶基因。
　　第三部分 miR-26b下调EphA2表达影响肝癌细胞增殖、迁移和侵袭研究
　　目的:
　　研究miR-26b和EphA2的表达对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
　　方法:
　　miR-26b mimics、miR-26b inhibitor和阴性对照(negative control)购买自RiboBio公司(Guangzhou，Guangdong，China)，并将其转染入肝癌细胞中，分别用来过表达miR-26b、miR-26b沉默和相应阴性对照。EphA2 mimics、miR-26b和EphA2对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响分别使用Cell Counting Kit(CCK-8)、transwell invasion方法和wound healing方法进行检测。细胞CCK8增殖能力检测，设置时间点分别为0、12、24、48、72、96h。使用western blot分析转录基因c-Myc、cyclin D1表达水平。
　　结果:
　　1.将miR-26b mimics、EphA2 mimics和阴性对照(negative control)，转染入肝癌细胞后，24小时检测miR-26b和EphA2的表达。我们发现，miR-26b mimics转染能够明显提高肝癌细胞中miR-26b的表达水平，差异有统计学意义(p＜0.05);EphA2 mimics转染能够明显提高肝癌细胞中EphA2的表达水平，差异有统计学意义(p＜0.05);随后，我们将miR-26b mimics和EphA2 mimics共转染肝癌细胞，我们发现共转染miR-26bmimics和EphA2 mimics的肝癌细胞中miR-26b的表达水平明显高于阴性对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)。
　　2.CCK-8分析揭示了miR-26b和EphA2表达对肝癌细胞增值能力的影响。结果显示:过表达miR-26b的肝癌细胞的增殖活性从24 h开始低于对照组细胞，差异有统计学意义(p＜0.01)，在48 h和72 h，过表达miR-26b的肝癌细胞其增殖活性也明显低于对照组细胞，差异有统计学意义(p＜0.01)。但是，共转染miR-26b mimics和EphA2 mimics细胞的增值能力与对照组细胞相比反而升高，并在48 h达到平台期，差异有统计学意义(p＜0.01)。
　　3.Transwell侵袭结果表明:与对照组相比，过表达miR-26b肝癌细胞的侵袭能力明显降低，差异有统计学意义(p＜0.01)。但是，共转染miR-26b mimics和EphA2 mimics的细胞与对照组细胞相比其侵袭能力反而升高，差异有统计学意义(p＜0.01)。
　　4.Wound-healing结果表明:过表达miR-26b肝癌细胞的迁移能力明显低于对照组细胞，差异有统计学意义(p＜0.01)。但是，共转染miR-26b mimics和EphA2 mimics的细胞与对照组细胞相比其迁移能力反而升高(p＜0.01)。
　　5.Western blot结果表明:miR-26b mimics能显著降低肝癌细胞内EphA2、c-Myc和cyclin D1等蛋白的表达水平，差异有统计学意义(p＜0.01);共转染miR-26b mimics和EphA2 mimics的细胞与对照组细胞相比，肝癌细胞内EphA2、c-Myc和cyclin D1的表达水平明显升高，差异有统计学意义(p＜0.01)。
　　结论:
　　miR-26b能通过靶向抑制EphA2的表达来降低肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力，c-Myc-CyclinD1信号通路可能是实现这一调控作用的途径。

目录

声明

摘要

符号说明

研究背景(包含综述)

参考文献

第一部分 microRNA-26b、EphA2在多种肝癌细胞中的表达及其意义

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附：图表

参考文献

第二部分 microRNA-26b调控EphA2表达的报告基因验证

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附：图表

参考文献

第三部分 MiR-26b下调EphA2表达影响肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附：图表

参考文献

致谢

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