基于PEG-PLL-PLGA聚合物纳米药物传输系统靶向逆转肿瘤多药耐药的研究

摘要

本文分两个部分：
　　第一部分 PEG-PLL-PLGA聚合物纳米粒的生物相容性以及安全性研究
　　目的：本部分实验研究评估聚乙二醇(PEG)-聚赖氨酸(PLL)-聚乳酸羟基乙酸(PLGA)(PEG-PLL-PLGA)纳米粒(nanoparticles，NPs)的生物相容性及安全性。
　　方法：选用可生物降解材料PEG、PLL及PLGA作为合成新型纳米载药系统(nanodrug delivery system，NDDS)的原料，通过优化反应条件，制得PEG-PLL-PLGA聚合物纳米粒，并将PEG-PLL-PLGA包载经典化疗药物柔红霉素(doxorubicin，DNR)。采用一系列实验检测该纳米材料的生物相容性，如MTT实验评价PEG-PLL-PLGA对小鼠成纤维细胞L929的细胞毒性;流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测细胞内DNR浓度和细胞凋亡率;溶血试验评价纳米粒有无溶血作用;小鼠尾静脉注射DNR-PEG-PLL-PLGA以测定其半数致死量(median lethal dose，LD50);急性毒性实验采用小鼠眼球取血方法，检测小鼠肝肾功能;病理组织学苏木素-伊红(haematoxylin-eosin，HE)染色检测小鼠主要脏器的病理变化;微核试验(micronucleus，MN)评价其有无致畸及致突变作用。
　　结果：成功制备PEG-PLL-PLGA聚合物纳米粒，透射电镜（transmission electronmicroscope，TEM）下PEG-PLL-PLGA呈球形或近似球形，表面光滑，平均粒径为229±15 nm，多分散系数(polydispersity index，PI)为0.085±0.017(n=3)，Zeta电位为-20.1±1.6 mV;不同浓度的PEG-PLL-PLGA纳米粒的细胞毒性均为1级，均属对细胞无毒性范畴;FCM显示DNR组的相对荧光强度(relative fluorescenceintensity, RFI)为4.27±2.06，DNR-PEG-PLL-PLGA组RFI为4.39±1.89，与空白对照组相比，DNR组和DNR-PEG-PLL-PLGA组均能显著增加细胞内DNR浓度(P＜0.05)，PEG-PLL-PLGA实验组与对照组相比，凋亡率没有显著差异(P＞0.05);肉眼观察法显示无溶血发生;LD5o为464.4 mg/kg，95％的可信区间为399-541.8 mg/kg，纳米粒具有较广的安全值范围;组织病理学HE染色检测示，DNR-PEG-PLL-PLGA实验组与对照组相比，没有显著的组织结构和细胞的病理变化形态;微核试验证实该纳米材料无致畸或致突变作用。
　　结论：PEG-PLL-PLGA在体外和体内均无毒性，具有良好的生物相容性，同时为PEG-PLL-PLGA作为化疗药物传输系统的载体奠定了基础。
　　第二部分 PEG-PLL-PLGA聚合物纳米粒的靶向逆转肿瘤多药耐药研究
　　目的：本部分实验研究转铁蛋白(transferrin，Tf)修饰的PEG-PLL-PLGA纳米粒共聚合抗肿瘤药物DNR和汉防己甲素(Tetrandrine，Tet)治疗白血病裸鼠移植瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)的疗效及体内靶向性分布。
　　方法：选用复乳化溶剂挥发法制各共载DNR和Tet的PEG-PLL-PLGA，利用载体末端羟基二咪唑(carbonyldiimidazole，CDI)基团能自发地与Tf的氨基反应，形成Tf-PEG-PLL-PLGA，采用高速冷冻离心法及凝胶渗透色谱法检测蛋白交联率，合成DNR-Tet-Tf-PEG-PLL-PLGA（PEG-PLL-PLGA缩写成NPs，即DNR-Tet-Tf-NPs）聚合物载药纳米粒。建立白血病耐药细胞株K562/A02裸鼠皮下移植瘤模型，当肿瘤长大至75-150 mm3时，随机分为6组:生理盐水对照组，DNR组，DNR和Tet组，DNR-NPs组，DNR-Tet-NPs组和DNR-Tet-Tf-NPs组，每组6只，采用尾静脉注射方式，隔天给药，观察纳米粒的抗肿瘤作用，并测定肿瘤的生长体积，计算肿瘤抑瘤率。用药14天后处死动物，取各组心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肿瘤组织行病理学观察。免疫组化检测肿瘤组织中凋亡相关基因Caspase-3，Bax，Bcl-2和Survivin的表达。使用实时荧光定量PCR(quantitativereal-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)以及免疫蛋白印迹试验(Westernblot)检测肿瘤靶向及耐药相关抗体TfR, P-gp，MRP和NF-κB的mRNA及蛋白的表达。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)检测DNR在血浆、肿瘤组织和主要脏器的浓度。FCM检测近红外染料(near-infraredfluorescent，NIRF)NIR797是否包载至纳米粒中，近红外活体成像实验检测NIR797-labeled DNR-NPs和NIR797-labeled DNR-Tf-NPs在裸鼠体内的分布情况。
　　结果：DNR-Tet-Tf-NPs组肿瘤抑制率最高(P＜0.05)，抑瘤作用最强，同时能够逆转肿瘤MDR，且具有靶向抗肿瘤作用。HE染色显示各组心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肿瘤组织无明显病理改变。肿瘤组织免疫组化观察显示，与对照组和DNR组相比，Bax和Caspase-3蛋白在DNR-Tet-NPs组和DN-Tet-Tf-NPs组中表达明显增加，而Bcl-2和Survivin蛋白表达明显减少，并且在DNR-Tet-Tf-NPs组中Bax和Caspase-3蛋白表达最强，Bcl-2和Survivin蛋白表达最弱。实时定量PCR和Western blot检测结果示DNR-Tet-Tf-NPs组能够下调P-gp，MRP，NF-κB的mRNA及蛋白的表达，上调TfR的mRNA及蛋白的表达。HPLC实验结果显示DNR-Tet-Tf-NPs组经裸鼠尾静脉给药4h后，在肿瘤组织中的DNR浓度明显高于DNR-Tet-NPs组。近红外活体成像结果显示，通过主要脏器及肿瘤部位的近红外成像发现，大量的荧光信号主要聚集在肿瘤部位。在注射72 h后，最强的信号到达了裸鼠成瘤的部位。非Tf修饰的NIR797-labeled DNR-NPs组也有相同的成像的结果，但是肿瘤的荧光信号比Tf修饰的NIR797-labeledDNR-Tf-NPs组弱。
　　结论：DNR-Tet-Tf-NPs具有良好的逆转耐药及主动靶向能力，为肿瘤的靶向治疗提供了一条新途径。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

文献综述 纳米载药系统在肿瘤多药耐药及靶向治疗中的研究进展

一、引言

二、MDR的细胞机制

三、纳米药物治疗肿瘤及当前临床状态

四、评价纳米药物输送机制及治疗MDR肿瘤

五、纳米粒的靶向给药

六、靶向纳米粒的临床进展

七、结论

第一部分 PEG-PLL-PLGA聚合物纳米粒的生物相容性以及安全性研究

一、实验材料

1．主要实验试剂

2．主要实验仪器

3．实验细胞和动物

二、实验方法

1．PEG-PLL-PLGA的制备和表征

2．PEG-PLL-PLGA聚合物纳米粒的细胞毒性实验(MTT法)

3．流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测L929细胞内DNR浓度

4．FCM检测L929细胞凋亡率

5．溶血试验

6．半数致死量(LD50)测定

7．病理组织学检测

8．急性毒性实验

9．微核试验(Marrow Micronucleus，MN)

10．统计学处理

三、实验结果

1．PEG-PLL-PLGA聚合物纳米粒的表征

2．MTT检测细胞毒性试验

3．FCM检测L929细胞内DNR浓度

4．FCM检测L929细胞凋亡率

5．溶血试验结果

6．LD50结果

7．病理组织学检测结果

8．急性毒性实验检测肝肾功能

9．MN实验结果

四、讨论

五 结论

第二部分 PEG-PLL-PLGA聚合物纳米粒的靶向逆转肿瘤多药耐药研究

一、实验材料

1．主要实验试剂

1 主要实验仪器

二、实验方法

1．DNR-Tet-Tf-PEG-PLL-PLGA的制备

2．细胞系和培养条件

3．MDR裸鼠皮下移植瘤模型的建立

4．肿瘤生长测量和抑制率

5．病理组织学检测

6．免疫组化分析

7．实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测

8．Western blot检测

9．高效液相色谱(HPLC)分析法检测DNR浓度

10．NIR797-labeled纳米粒在体外体内的实验

11．统计学处理

三、实验结果

1．纳米粒的表征

2．K562／A02移植瘤各组的相对肿瘤体积以及肿瘤抑制率

3．肿瘤组织病理学检查

4．Bax，caspase-3，Bcl-2和survivin在体内的凋亡表达情况

5．TfR，P-gP，MRP和NF-κB的mRNA和蛋白的表达

6．HPLC检测组织分布

7 NIR797-labeled纳米粒在体外体内的实验结果

四、讨论

五 结论

总结与展望

参考文献

博士在读期间发表文章

攻读博士学位期间发表的会议论文

致谢

作者简介