牙囊细胞通过RUNX2-MiR-31-SATB2环路调节牙萌出的机制研究

摘要

颅骨锁骨发育不全(CCD)是一种罕见的常染色体显性遗传病，致病机理主要是位于第6染色体p21位的Runt相关转录因子2(RUNX2)基因突变，导致RUNX2单倍剂量不足，临床主要表现为骨骼发育不良和牙齿迟萌、阻生等。研究表明，CCD患者RUNX2单倍剂量不足可能会导致牙囊介导的成骨—破骨调节平衡紊乱。RUNX2作为转录抑制因子调节microRNA-31(miR-31)的表达，而miR-31的下游调节因子SATB2与RUNX2存在调节关系，因此，存在RUNX2-miR-31-SATB2间的生理性调节环路，但是否参与牙囊细胞调节的牙萌出机制尚不清楚。本研究分为三个部分：
　　第一部分：颅骨锁骨发育不全患者牙囊细胞的体外分离培养及生物学特性。
　　目的：体外分离并培养CCD患者及正常同龄对照组的牙囊细胞(dentalfollicle cells, DFCs)，并对DFCs的生物学特性进行比较分析。
　　方法：利用牙囊组织块贴壁法体外提取并培养DFCs，待细胞自组织块中爬出，形成集落并且当各集落相互接触时进行传代培养;通过细胞免疫荧光鉴定DFCs;采用用结晶紫染液染色培养12 d的两种DFCs，分析其克隆形成能力;MTT法与BrdU细胞增殖实验分析CCD患者及正常同龄对照DFCs的增殖能力;并用成骨诱导液诱导两种DFCs成骨分化，Western blot和茜素红染色法分析成骨能力;实时定量PCR分析破骨激活因子基因表达。
　　结果：⑴CCD患者的DFCs(DFCs-CCD)与正常DFCs(DFCs)无明显的形态学差异，两者的Vimentin均为阳性表达，上皮标记物Cytokeratin均阴性表达。⑵DFCs-CCD的克隆集落多于DFCs，MTT实验中，同一时间点DFCs-CCD的吸光度值高于DFCs，DFCs-CCD的BrdU阳性率高于DFCs。⑶与正常DFCs相比，DFCs-CCD中RUNX2、Osterix、骨钙素(osteocalcin，Ocn)等成骨相关蛋白表达水平低，且形成钙化结节少。⑷DFCs-CCD高表达核因子-κB受体活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB，RANK)和骨保护素(osteoprotegerin，OPG)等破骨抑制相关因子(P＜0.05)，而RANK配体(receptoractivator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)水平无统计学差异(P＞0.05)。
　　结论：与DFCs相比，DFCs-CCD具有更强的增殖、克隆形成能力，但成骨分化能力较弱，破骨活性抑制因子高表达。
　　第二部分：RUNX2-miR-31-SATB2调控牙囊细胞参与牙萌出的机制。
　　目的：分析RUNX2-miR-31-SATB2环路对牙囊细胞侵袭、破骨细胞激活功能的影响，探讨该环路参与牙囊细胞调控牙萌出的机制。
　　方法：⑴Western blot、Real-time PCR检测RUNX2、SATB2、miR-31在DFCs、DFCs-CCD中的表达差异。⑵Transwell穿膜实验比较侵袭能力，并用Western blot及明胶酶谱检测其MMP9、MMP2表达。⑶Real-time PCR检测破骨激活因子表达，并通过牙囊细胞-骨髓细胞共培养诱导破骨，检测其诱导破骨能力差异。⑷通过敲减DFCs-CCD的miR-31表达，检测其RUNX2、SATB2表达变化及诱导破骨能力的改变;通过过表达DFCs的miR-31，反向验证RUNX2、SATB2及诱导破骨能力的改变。
　　结果：①与DFCs相比，DFCs-CCD中RUNX2、SATB2低表达，而miR-31高表达。②DFCs-CCD穿膜侵袭能力较弱，且MMP9、MMP2表达及活性较低。③DFCs-CCD的破骨激活因子表达、诱导破骨能力均较正常DFCs低。④DFCs-CCD敲减miR-31，可以逆转上述结果;相反， DFCs过表达miR-31，获得与DFCs-CCD相似的结果。
　　结论：CCD患者RUNX2基因突变导致其表达下降，进而导致miR-31表达升高及其靶基因SATB2表达下调，RUNX2-miR-31-SATB2可能参与CCD患者恒牙迟萌，操纵RUNX2-miR-31-SATB2环路有可能促进牙萌出。
　　第三部分：RUNX2-miR-31-SATB2环路参与牙萌出的动物实验研究。
　　目的：通过新生小鼠体内干扰RUNX2表达，探讨RUNX2-miR-31-SATB2对牙萌出的影响。
　　方法：对出生当日的C57BL/6J小鼠注射体内RUNX2干扰试剂，对实验第8天的小鼠下颌骨标本行免疫荧光检测RUNX2表达;TRAP染色检测牙囊周围活性破骨细胞;并提取牙囊组织的蛋白及RNA，分别检测RUNX2、SATB2蛋白及miR-31表达。对实验第14天的小鼠行microCT检测，观察其牙齿萌出情况。
　　结果：⑴体内干扰RUNX2第8天后，牙囊组织中RUNX2及SATB2表达均低于对照组，而miR-31表达升高。⑵实验组牙囊周围牙槽骨中的破骨细胞明显少于对照组。⑶体内干扰RUNX2第14天后，microCT结果显示实验组牙齿萌出延迟。
　　结论：体内RUNX2干扰法可以模拟CCD患者的牙萌出，RUNX2-miR-31-SATB2环路可能是牙囊细胞调节牙萌出的重要生物学机制。

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论文说明

英文缩略词表

摘要

前言

第一部分 颅骨锁骨发育不全患者牙囊细胞的体外分离培养及生物学特性

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

第二部分 RUNX2-miR-31-SATB2调控牙囊细胞参与牙萌出的机制

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

第三部分 RUNX2-miR-31-SATB2环路参与牙萌出的动物实验研究

1．1 材料与方法

1．2 实验方法

2．结果

3．讨论

全文总结

参考文献

综述 牙萌出相关细胞及分子生物学机制进展

攻读学位期间发表文章情况

致谢