MicroRNA-491靶向作用EGFR通过STAT3信号通路在肝细胞癌肿瘤干细胞特性中作用的机制研究

摘要

目的:
　　阐述miR-491对肝癌肿瘤干细胞特性获得的分子调控机制及其对肝细胞肝癌发生发展及转移复发的影响，为今后肝癌发生发展及预后复发的诊断、靶向治疗以及患者预后预测提供新的途径和研究思路。
　　方法:
　　一、miR-491在肿瘤组织、正常组织的表达与肝癌细胞转移潜能的相关关系
　　1.肝癌组织与正常组织miRNA-491表达差异检测:实时定量转录PCR(qRT-PCR)方法检测miRNA-491在肿瘤组织和正常组织中的表达;
　　2.肝癌细胞miR-491和检测:实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)方法检测miR-491在不同转移潜能肝癌细胞系中表达水平;
　　二、miR-491影响肝癌细胞肿瘤干细胞特性获得
　　miR-491表达水平变化对肝癌细胞集落形成能力及肿瘤干细胞成球能力影响检测:肝癌细胞MHCC97H和HepG2内分别转染miR-491-mimic/inhibitor，肿瘤细胞集落形成实验及悬浮克隆细胞球形成实验检测肿瘤干细胞性的变化。
　　三、miR-491在肝癌细胞系中通过EGFR调控STAT3
　　1.miR-491表达水平变化对肝癌细胞EGFR和STAT3表达影响检测:肝癌细胞MHCC97H和HepG2内分别转染miR-491-mimic/inhibitor，Western blot检测EGFR和STAT3蛋白及磷酸化水平变化;
　　2.miR-491表达水平变化对肝癌细胞EGFR的影响检测:肝癌细胞MHCC97H细胞内共转染pEGFP-EGFR3'UTR-Luc和miR-491-mimic，肝癌细胞HepG2内共转染pEGFP-EGFR3'UTR-Luc和miR-491-inhibitor,荧光素酶报告基因实验检测EGFR荧光素酶活性变化;
　　3.EGFR表达水平变化对肝癌细胞STAT3的影响检测:肝癌细胞HepG2内转染miR-491-inhibitor24 h后，继续用EGFR siRNA处理细胞12h，Western blot检测EGFR和STAT3蛋白水平变化，肝癌细胞MHCC97H内转染miR-491-mimic24 h后，继续用EGFR高表达质粒处理细胞12h，Westem blot检测EGFR和STAT3蛋白水平变化。
　　四、EGFR/STAT3对肝癌细胞肿瘤干细胞特性获得及侵袭转移的影响
　　1.EGFR/STAT3表达水平变化对肝癌细胞肿瘤干细胞成球能力影响及肿瘤细胞集落形成能力检测:肝癌细胞MHCC97H内共转染miR-491-mimic及STAT3高表达质粒和肝癌细胞HepG2细胞内共转染miR-491-inhibitor及STAT3 siRNA，悬浮克隆细胞球形成实验及集落形成实验检测肿瘤干细胞成球能力变化。
　　2.EGFR/STAT3表达水平变化对肝癌细胞侵袭转移能力检测:肝癌细胞MHCC97H内共转染miR-491-mimic及STAT3高表达质粒和肝癌细胞HepG2细胞内共转染miR-491-inhibitor及STAT3siRNA，transwell实验检测肿瘤细胞侵袭转移能力变化。
　　结果:
　　一、miR-491和肝癌细胞转移潜能和肿瘤组织相关
　　qRT-PCR方法分别检测肝癌细胞系和肝癌组织、正常组织miR-491表达水平结果发现:miR-491表达与细胞转移潜能呈负相关，在肝癌组织中表达远低于正常组织。
　　二、miR-491影响肝癌细胞肿瘤干细胞特性获得结果发现转染miR-491-mimic的MHCC97H细胞肿瘤干细胞成球能力较对照组显著降低;而转染miR-491-inhibitor的HepG2细胞肿瘤干细胞成球能力较对照组明显升高。
　　三、miR-491在肝癌细胞系中通过EGFR调控STAT3
　　1.在肝癌细胞MHCC97H中上调miR-491后，结果发现EGFR蛋白水平明显降低，STAT3蛋白磷酸化水平均明显降低;而肝癌细胞HepG2下调miR-491后，EGFR蛋白水平明显升高，STAT3蛋白磷酸化水平明显升高;
　　2.肝癌细胞MHCC97H内共转染pEGFP-EGFR3'UTR-Luc和miR-491-mimic，结果发现EGFR与miR-491启动子区能够结合，上调miR-491水平， EGFR荧光素酶活性下降，肝癌细胞HepG2内共转染pEGFP-EGFR-3'UTR-Luc和miR-491-inhibitor，结果发现EGFR与miR-491启动子区能够结合，下调miR-491水平，EGFR荧光素酶活性上升。说明在肝癌细胞中，miR-491可以直接靶向调控EGFR;
　　3.使用miR-491-inhibitor处理HepG2细胞后，再用EGFR siRNA处理HepG2细胞后，结果发现抑制EGFR可使miR-491所致HepG2细胞STAT3的蛋白磷酸化水平升高回降;使用miR-491-mimic处理MHCC97H细胞后，再用EGFR高表达质粒处理细胞后，结果发现高表达EGFR可使miR-491所致MHCC97H细胞STAT3蛋白磷酸化水平降低回升。说明miR-491所致肝癌细胞STAT3表达水平变化是通过EGFR来完成的。
　　四、miR-491/STAT3对肝癌细胞干细胞特性和侵袭转移能力的影响
　　1.肝癌细胞MHCC97H内转染miR-491-mimic后，结果发现肿瘤干细胞成球及集落形成能力亦明显减弱，共转染miR-491-mimic及STAT3高表达质粒，结果发现高表达STAT3可使miR-491-mimic所致肿瘤于细胞成球能力及集落形成减弱回高;肝癌细胞HepG2内转染miR-491-inhibitor后，结果发现肿瘤干细胞成球及集落形成能力明显升高，共转染miR-491-inhibitor及STAT3 siRNA，结果发现低表达STAT3可使miR-491-inhibitor所致肿瘤干细胞成球及集落形成能力能力升高回降。
　　2.肝癌细胞MHCC97H内转染miR-491-mimic后，结果发现肿瘤细胞侵袭转移能力明显减弱，共转染miR-491-mimic及STAT3高表达质粒，结果发现高表达STAT3可使miR-491-mimic所致肿瘤细胞侵袭转移能力减弱回高;肝癌细胞HepG2内转染miR-491-inhibitor后，结果发现肿瘤细胞侵袭转移能力明显升高，共转染miR-491-inhibitor及STAT3 siRNA，结果发现低表达STAT3可使miR-491-inhibitor所致肿瘤细胞侵袭转移能力升高回低。
　　结论:
　　1.miR-491和肿瘤细胞恶性程度及肝癌分期相关;
　　2.miR-491在肝癌细胞中抑制肿瘤干细胞特性获得;
　　3.miR-491通过靶蛋白EGFR调控STAT3;
　　4.EGFR/STAT3参与了HCC的肿瘤干细胞特性获得过程及侵袭转移能力过程。
　　总之，本研究结果提示miR-491可以通过调控靶蛋白EGFR降低STAT3的磷酸化水平，抑制肝癌细胞干细胞特性获得，从而影响肿瘤细胞侵袭转移。本研究结果说明miR-491与肝癌干细胞特性获得的通路调控在肝癌发生发展和预后复发中发挥重要作用。

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