HIF-2α调控miR-191在亚砷酸钠所致细胞恶性转化中的作用及机制研究

摘要

近年来，从表观遗传学角度探讨微小RNA(microRNA，miRNA)表达异常在砷化物所致细胞恶性转化过程中的作用，已经成为砷化物致癌机制研究的热点。miRNA在人类多种肿瘤中表达发生改变，发挥抑癌或致癌的作用，与肿瘤发生、发展、诊断、治疗及预后密切相关。尽管miRNA在肿瘤中的功能已有许多研究报道，但是其在环境致癌物诱导细胞恶性转化和致癌过程中的作用及其分子机制却知之甚少。miR-191是一个高度保守的miRNA，在多种癌症中均高表达，可以调节细胞增殖、分化、凋亡与迁移等功能。有研究出现miR-191表达水平受转录因子、肿瘤微环境（缺氧）和表观遗传学作用的调控，但砷化物与miR-191之间的联系还未有阐述。上皮-间质转化(EMT)、肿瘤干细胞(CSCs)样特性和血管生成与多种疾病存在联系，特别与恶性肿瘤的发生、发展和转移密切相关。本课题组以往研究已发现NaAsO2通过抑制泛素化过程使HIF-2α水平升高，进一步促使细胞在恶性转化过程中发生EMT和CSCs，但是具体的生物学机制尚不清楚。结合文献报道miRNA可以调控EMT、CSCs和血管生成的生物学进程。因此，我们推测HIF-2α通过miR-191启动EMT、CSCs和血管生成参与了NaAsO2所致细胞恶性转化过程。为此，本研究在课题组前期构建的NaAsO2慢性处理所致人支气管上皮(HBE)细胞恶性转化模型基础上，应用多种分子生物学方法探讨HIF-2α调控miR-191的作用与EMT、CSCs和血管生成之间的关系在NaAsO2诱导HBE细胞发生恶性转化过程中的作用和机制，以研究NaAsO2所致细胞发生恶性转化的关键分子机制，从而为探讨砷化物致癌的分子机制和寻找砷中毒的新型生物学标靶提供一定的科学依据。本研究分为两个部分：
　　第一部分：miR-191调控EMT和CSCs特性获得在亚砷酸钠所致HBE细胞恶性转化中的作用。
　　目的：探讨NaAsO2通过miR-191调控EMT和CSCs特性获得的分子机制及其在NaAsO2所致HBE细胞恶性转化中的作用。
　　方法：以本课题组之前成功构建NaAsO2所致HBE细胞恶性转化模型为研究基础，运用miRNA芯片技术检测正常和恶性转化HBE细胞之间miRNA表达谱的差异;qRT-PCR技术检测细胞miRNA水平;荧光素酶报告基因检测miR-191与BASP13'UTR区结合情况;Western blot技术检测EMT指标、BASP1及其下游基因的蛋白水平;免疫荧光观察相关蛋白在细胞内的定位情况;干细胞悬浮成球、侧群细胞流式筛选和RT-PCR方法检测CSCs特性指标;软琼脂集落形成、划痕损伤和Transwell实验探讨细胞恶性程度、迁移能力、侵袭转移能力，最终探讨miR-191调控EMT和CSCs特性获得在NaAsO2所致HBE细胞恶性转化中的作用。
　　结果：⑴使用miRNA芯片检测发现，NaAsO2所致恶性转化HBE细胞中发生异常表达的miRNA有51种，这其中有30种miRNA水平上调，而另外21种水平下调;进一步qRT-PCR验证发现miR-21、miR-31和miR-191水平显著升高，而miR-200c水平显著降低，其中miR-191水平升高在芯片结果和qRT-PCR结果中都是最明显的，因此选择miR-191作为本次研究对象。提示miR-191水平与NaAsO2所致HBE细胞恶性转化可能存在密切的关系。⑵分别用0.0和1.0μM NaAsO2慢性处理HBE细胞10、20和30代后，结果发现miR-191水平逐渐升高，随NaAsO2处理时间延长，升高趋势也越明显。用1.0μMNaAsO2急性处理HBE细胞3、6、12和24 h后，检测发现HBE细胞miR-191水平显著升高。提示，NaAsO2对HBE细胞miR-191水平具有重要的调控作用。⑶使用0.0和1.0μM NaAsO2慢性长期处理HBE细胞10、20和30代，或急性处理HBE细胞3、6、12和24 h后，结果发现HBE细胞BASP1水平随NaAsO2处理处理时间延长而逐渐下降，而WT1、Wnt1和β-catenin水平则逐渐升高，具有一定时间-效应关系。使用生物软件数据库预测BASP13'UTR存在miR-191结合位点;应用荧光素酶报告基因实验发现NaAsO2引起BASP1荧光素酶报告基因活性下降，但下调miR-191水平可拮抗此作用。通过转染150nManti-miR-191而下调miR-191水平可明显阻滞NaAsO2所致HBE细胞BASP1水平降低和WT1、Wnt1和β-catenin水平升高。使用pEGFP-BASP1质粒或siRNA上调或下调BASP1水平可显著阻滞NaAsO2所引起HBE细胞WT1水平改变。荧光显微镜检测发现NaAsO2引起HBE细胞β-catenin从细胞浆进入核内，而应用siRNA下调WT1水平可以明显阻滞NaAsO2引起的HBE细胞Wnt1和β-catenin水平升高。提示miR-191通过靶向BASP1调控WT1水平在NaAsO2激活Wnt/β-catenin通路中发挥了重要的作用。⑷分别用0.0和1.0μM NaAsO2慢性处理HBE细胞30代（约15周）后，使用150 nManti-miR-191转染NaAsO2所致恶性转化HBE细胞，结果发现下调miR-191水平可明显引起NaAsO2所致恶性转化HBE细胞BASP1水平升高和WT1、Wnt1和β-catenin水平降低;上皮细胞标志E-cadherin水平上升，而间质细胞标志Vimentin和N-cadherin水平下降;悬浮细胞成球数量减少，肺癌干细胞表面标志CD133和CD44 mRNA水平降低，SP侧群细胞的比例数降低。提示miR-191在NaAsO2所致恶性转化HBE细胞EMT发生和CSCs特性获得中发挥了重要的生物学作用。⑸分别用0.0和1.0μM NaAsO2慢性处理HBE细胞30代（约15周）后，使用150 nM anti-miR-191转染NaAsO2所致恶性转化HBE细胞。结果发现下调miR-191水平可引起NaAsO2所致恶性转化HBE细胞的软琼脂克隆形成数目明显减少;划痕损伤后生长面积的明显下降;侵袭细胞数和转移细胞数明显减少。提示，miR-191在NaAsO2所致恶性转化HBE细胞恶性程度和侵袭转移中发挥重要作用。
　　结论：NaAsO2引起HBE细胞miR-191和WT1水平升高及BASP1水平降低，并激活Wnt/β-catenin通路;miR-191通过抑制其靶基因BASP1而上调WT1水平进而激活Wnt/β-catenin通路参与了NaAsO2所致HBE细胞发生EMT和获得CSCs特性过程，从而促进HBE细胞发生恶性转化而具有侵袭迁移能力。
　　第二部分：HIF-2α调控miR-191在亚砷酸钠所致恶性转化HBE细胞的血管生成和转移中的作用。
　　目的：研究HIF-2α调控miR-191及其靶基因的分子机制及其在NaAsO2所致恶性转化HBE细胞的血管生成和转移中的作用。
　　方法：以本课题组之前成功构建NaAsO2所致HBE细胞恶性转化模型为研究基础，应用Western blot检测NaAsO2对HBE细胞HIFs、MMP-9和VEGF水平的影响;用ELISA实验检测细胞分泌VEGF的情况;HUVEC微管生成实验检测细胞血管生成能力;ChIP实验检测HIF-2α与miR-191启动子区的结合情况;荧光素酶报告基因实验检测HIF-2α对miR-191的转录调控作用;Trasnswell实验检测NaAsO2所致恶性转化HBE细胞侵袭和迁移能力;并观察应用siRNA技术或/和miRNA-mimic转染敲除HIF-2α或/和上调miR-191水平单独或交互作用对NaAsO2所致恶性转化HBE细胞以上相关指标的影响。从而探讨HIF-2α调控miR-191在NaAsO2所致恶性转化HBE细胞血管生成和转移中的作用。
　　结果：⑴分别用0.0和1.0μM NaAsO2慢性处理HBE细胞10、20和30代（约15周）;结果显示NaAsO2引起HBE细胞HIF-2α、MMP-9和VEGF水平逐渐升高，且随处理时间延长，其升高也越明显;分别用1.0μM NaAsO2处理HBE细胞3、6、12和24 h后，结果发现HBE细胞HIF-2α和VEGF水平升高。提示NaAsO2引起HBE细胞HIF-2α、MMP-9和VEGF水平升高。⑵分别用0.0和1.0μM NaAsO2慢性处理HBE细胞30代（约15周）后，结果显示NaAsO2所致恶转化HBE细胞分泌VEGF水平升高;用NaAsO2所致恶转化HBE细胞培养液处理HUVEC细胞，发现微管生成长度也增加。提示NaAsO2所致恶性转化HBE细胞具有促血管生成能力。⑶使用1.0μM HIF-2α抑制剂Topotecan处理HBE细胞3h后;或用25 nMHIF-2α-siRNA处理HBE细胞24 h后，再用0.0和1.0μM NaAsO2处理HBE细胞24 h。结果发现抑制或敲除HIF-2α可阻滞NaAsO2引起的HBE细胞miR-191、WT1和VEGF水平升高及BASP1水平降低。分别用0.0和1.0μM NaAsO2处理HBE细胞24 h后，用ChIP实验发现NaAsO2可以增强HBE细胞HIF-2α和miR-191启动子区的结合。使用25 nM HIF-2α-siRNA和报告基因相关质粒转染HBE细胞24 h后，再用0.0和1.0μMNaAsO2处理HBE细胞24 h，结果显示NαAsO2可明显引起miR-191启动子区荧光素酶报告基因活性升高，但当下调HIF-2α水平则可阻滞这种作用。提示HIF-2α调控miR-191在NaAsO2所致BASP1及其下游因子发生改变中发挥重要作用。⑷分别用0.0和1.0μM NaAsO2慢性处理HBE细胞30代（约15周）后，再使用25 nMHIF-2α-siRNA或/和80 nM miR-191-mimic共转染NaAsO2所致恶性转化HBE细胞。结果发现下调HIF-2α可以引起NaAsO2所致恶性转化HBE细胞miR-191水平显著降低，而上调miR-191水平则可拮抗此作用;siRNA敲除HIF-2α水平可引起NaAsO2所致恶性转化HBE细胞BASP1水平升高，而WT1、MMP-9和VEGF水平下降，细胞VEGF分泌水平降低，其培养液处理的HUVEC微管长度缩短，侵袭细胞和迁移细胞数降低，而上调miR-191水平可拮抗此作用。提示HIF-2α通过miR-191在NaAsO2所致恶性转化HBE细胞的血管生成和转移中发挥重要作用。
　　结论：NaAsO2可引起HBE细胞HIF-2α水平升高;HIF-2α与miR-191启动子区结合而转录调控miR-191水平及其靶基因BASP1，进一步升高WT1和VEGF水平。这一机制在NaAsO2所致恶性转化HBE细胞的血管生成和转移中发挥重要作用。综上所述，本研究主要发现：①NaAsO2慢性处理HBE细胞诱发恶性转化过程中多种miRNA表达谱发生改变，其中miR-191的上调最为明显。②miR-191通过抑制其靶基因BASP1而上调WT1水平进而激活Wnt/β-catenin通路参与了NaAsO2所致HBE细胞发生EMT和获得CSCs特性过程，从而促进HBE细胞发生恶性转化而具有侵袭迁移能力。③NaAsO2通过诱导HIF-2α水平升高，并引起HIF-2α与miR-191启动子区结合增加，从而上调miR-191水平。④HIF-2α转录调控miR-191水平及其靶基因BASP1，进一步升高WT1和VEGF水平在NaAsO2所致恶性转化HBE细胞的血管生成和转移中发挥重要作用。

目录

声明

缩略语

摘要

引言

第一部分 miR-191调控EMT和CSCs特性获得在亚砷酸钠所致HBE细胞恶性转化中的作用

材料与方法

结果

讨论

第二部分 HIF-2α调控miR-191在亚砷酸钠所致恶性转化HBE细胞的血管生成和转移中的作用

材料与方法

结果

讨论

结束语

参考文献

文献综述 miR-191的疾病生物学作用研究进展

附录

攻读博士学位期间已(待)发表的论文

攻读博士学位期间学术活动和获奖情况

致谢