蛋白酶体亚单位(PSMB1)与蚊生殖的关系研究

摘要

蚊媒病是危害人类健康的重要公共卫生问题，蚊媒控制是蚊媒病防治的主要手段，化学杀虫剂的使用导致的蚊媒抗药性加剧了蚊媒病的恶化趋势，研发可替代的新型杀虫剂是蚊媒防制研究的重点课题。采用抑制靶标昆虫种群繁殖势能的方法可以达到种群抑制的目的，因此深入研究雌蚊吸血和生殖产卵的分子机制，是有效控制蚊媒种群数量以及预防蚊媒病的重要措施。
　　本研究以淡色库蚊为研究对象，利用实时荧光定量PCR检测发现，蛋白酶体亚单位（PSMB1）在蛹阶段高表达，分别是羽化后3d的雌雄蚊的28倍（*P＜0.05）和9.5倍（*P＜0.05），而在羽化后0h至7d的雌雄蚊体内的表达水平立即下降，稳定且趋于一致。Western blot检测显示，PSMB1蛋白在蛹阶段不表达，羽化后3d的雌蚊体内开始检测到PSMB1，随后表达量逐渐增加。不论在基因表达还是蛋白表达，都提示我们PSMB1与蚊生长发育密切相关。根据PSMB1氨基酸序列预测的蛋白分子量大小约为24.88 KDa，Western blot实际检测蛋白分子量大小约为35 KDa，经去糖基化检测，显示PSMB1存在部分糖基化修饰。
　　随后用Western blot进行PSMB1体内表达定位，发现PSMB1主要在蚊胸腹表达，头、足翅基本不表达，说明其分布具有组织特异性。其次，实时荧光定量PCR检测吸血后的雌蚊体内组织特异性PSMB1的表达水平，发现吸血后雌蚊PSMB1表达水平不断上升，吸血后36h达到高峰，48h表达水平下降。
　　我们利用RNA干扰技术进一步验证PSMB1是否参与蚊吸血产卵生理过程。用显微注射方法敲低体内PSMB1的表达水平（***P＜0.001），我们首次发现PSMB1干扰后可以显著降低雌蚊产卵率（***P＜0.001），显著减少卵的数目（***P＜0.001）并显著降低卵的孵化率（***P＜0.001），提示PSMB1干扰显著影响雌蚊的生殖。解剖雌蚊卵巢发现，未处理组卵巢边缘整齐，PSMB1干扰组卵巢出现畸形，这可能是造成产卵率降低和卵数目减少的直接原因，且卵巢畸形可以影响后代的生存质量。PSMB1干扰后，检测其它蛋白酶体β亚单位的表达情况，PSMB2、PSMB3、PSMB6均有升高的现象（***P＜0.001，*P＜0.05），说明PSMB1可能与其他蛋白酶体β亚单位协同调控雌蚊生殖这一生理过程。
　　本课题首次发现蛋白酶体亚单位β6蛋白(PSMB1)在蚊幼虫期不表达，仅在雌蚊羽化后开始表达，随后表达量升高，且主要在腹部表达;抑制蛋白酶体催化亚单位表达似不影响雌蚊的吸血，但明显降低雌蚊的产卵率、卵数目和孵化率，提示蛋白酶体在蚊生殖中发挥重要作用。以PSMB1为靶点抑制雌蚊生殖势能，有望控制靶标蚊种群数量。本研究的结果可望为研发基于直接控制雌蚊繁殖势能的新型无污染生物杀虫剂奠定基础，为蚊媒综合防制提供一种全新方法。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

一、材料

(一)供试蚊

(二)主要试剂

(三)主要仪器设备

二、方法

(一)在mRNA水平上进行验证

(二)在蛋白水平上进行验证

(三)LC-MS-MS联用鉴定分析Western blot结果

(四)糖基化分析

(五)Western blot检测雌蚊各部位PSMB1的表达水平

(六)功能验证

结果

一、PSMB1在蚊不同发育时期的表达

(一)在mRNA水平上验证PSMB1在雌雄蚊不同发育时期的表达

(二)在蛋白水平上验证PSMB1在雌雄蚊不同发育时期的表达

二、液质联用鉴定分析Western blot结果

三、糖基化分析

四、Western blot检测雌蚊各部位PSMB1的表达水平

五、吸血前后雌蚊体内PSMB1的表达变化

六、PSMB1在雌蚊体内的作用

七、PSMB1影响雌蚊生殖的机制研究

讨论

小结

参考文献

综述 蛋白酶体在生殖系统中的作用

致谢