过表达20S蛋白酶体β5亚单位延缓人骨髓间充质干细胞复制性衰老

摘要

目的:探讨过表达20S蛋白酶体β5亚单位(PSMB5)对扩增晚期人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的增殖、分化及抗氧化能力的影响,寻求维持hBMSCs细胞活力的有效手段.方法:(1)构建PSMB5慢病毒载体,转染体外扩增晚期hBMSCs(MOI=60),对照组转染GFP慢病毒载体.(2)荧光定量PCR及Western blotting检测PSMB5的表达水平,化学发光法检测蛋白酶体活性.(3)Brdu掺入实验鉴定细胞增殖能力,CCK-8法检测细胞活力,衰老相关β-gal染色(SA-β-gal染色)计数衰老细胞数,Western blotting检测细胞周期相关蛋白,细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)的表达变化.(4)300uM双氧水处理hBMSCs30min,建立氧化应激模型,CCK-8法检测细胞存活率.(5)β-巯基乙醇和全反式维甲酸诱导hBMSCs向神经元分化,免疫荧光染色观察早期神经元标志物Tuj1阳性细胞率;脑内注射诱导分化后的hBMSCs,在体观察hBMSCs向神经元分化的能力.结果:(1)PSMB5慢病毒载体转染晚期hBMSCs后,PSMB5在mRNA水平较对照组上调5.24±0.21(p＜0.01),蛋白水平升高2.56±0.21倍(p＜0.01),蛋白酶体活性增强2.3±0.08倍(p＜0.01),提示过表达PSMB5能够上调晚期hBMSCs蛋白酶体活性.(2)PSMB5组Brdu阳性率较GFP对照组增加10％(p＜0.05),CCK-8结果显示PSMB5组细胞活力是对照组1.1±0.03倍(p＜0.05),SA-β-gal阳性细胞数较GFP对照组减少15％(p＜0.05),提示过表达PSMB5能够增强晚期hBMSCs细胞活力,有助于延缓复制性衰老进程.Western blotting结果显示PSMB5组,细胞周期相关蛋白Cyclin D1和CDK4表达水平分别较对照组升高56％和23％(p＜0.01),提示PSMB5过表达可能有利于推进细胞周期进程从而维持晚期hBMSCs增殖能力.(4)双氧水处理晚期hBMSCs,CCK-8实验显示PSMB5组较对照组细胞存活率增加1倍(p＜0.01),提示过表达PSMB5能够增强hBMSCs的抗氧化能力,提高细胞存活率.(5)经体外诱导分化后,PSMB5组Tuj1阳性率为29±3％,较对照组(22±2％)显著提高(p＜0.01).脑内注射诱导细胞,GFP组Tuj1阳性细胞呈圆形未见明显突起,而PSMB5组个别Tuj1阳性细胞伸出突起并向远端延伸,形态更接近成熟神经元,提示其过表达PSMB5有助于维持晚期hBMSCs分化潜能.结论:20S蛋白酶体亚单位PSMB5在维持hBMSCs增殖和分化潜能中发挥重要作用,过表达PSMB5可能是延缓hBMSCs复制性衰老的有效途径.