噪声性听力损失对成年小鼠空间学习记忆、海马神经新生和即刻早基因表达的影响

摘要

目的:
　　听力损失(hearing loss，HL)及认知障碍(cognitive impairment,CI)是两大类严重影响人类生活质量的高发病症。HL与CI的关系早已被关注。近年系列临床调查结果显示HL是全因痴呆(all-cause dementia)的独立风险因素，可能促进和加速后者发生发展。但由于人群调研不可避免地受到诸多因素的干扰与限制（例如共同病因的排除、听力水平对认知测试结果的影响、疾病机制研究的伦理限制等），HL与CI发生发展之关系的本质和机制尚未明确，因此需要动物实验予以证实和揭示。以往噪声引起CI发生已有很多报道，且已将噪声引起的CI与其对海马神经新生的抑制相联系。但以往研究均集中于噪声所致的应激效应对海马的损伤，而噪声性听力损失(noise induced hearing loss，NIHL)的作用完全被忽视。本课题组前期研究显示，短时噪声暴露后，机体的应激反应一过性增高，而在应激反应完全恢复很久以后出现CI以及相关海马神经新生的降低，提示HL而非氧化应激的作用。本研究在小鼠利用相同的噪声建立HL模型，观察了HL对成年小鼠空间学习记忆的影响，并在不同时间点采用复合指标观察了HL对海马神经新生的影响，以期证明HL可能通过对海马形态和功能的损伤促进CI的发生发展。
　　方法:
　　实验对象和主要检测指标:采用健康成年雄性CBA小鼠为实验对象，分为噪声组和对照组。其中噪声组动物给予123dB SPL高强度宽带白噪声短时暴露2h。通过测试听觉脑干诱发电位(auditory brainstem response，ABR)确定动物听力阈值，评估其HL程度。以Morris水迷宫(Morris water maze，MWM)检测动物的空间学习和记忆能力。以细胞分裂标记物，神经元标记物结合树突密度分析检测包括存活、分化成熟及神经网络发育的海马神经新生情况。通过实时定量PCR检测海马学习认知相关即刻早基因（immediate early expression genes，IEGs）表达。
　　实验分组与设计:本实验通过组间对照，首先检查在噪声暴露后短期内海马干细胞库和细胞新生能力是否改变。主要实验项目在噪声暴露后3个月（5月龄）完成。噪声组和对照组动物按是否接受MWM分为有训练和无训练两个亚组。训练结束后，取脑组织检测各项海马神经新生相关指标。
　　结果:
　　在噪声后一周内比较噪声组和对照组海马干细胞和新生细胞数量，排除应激损伤的作用。在噪声后三个月通过噪声组和对照组组间比较，确定NIHL对空间学习记忆能力、海马神经新生能力的影响及与HL程度的关联性。通过组内有/无(MWM)训练亚组之间的差异确定各组内MWM对海马新生细胞的拯救效应。进一步，通过比较NIHL组和对照组MWM的拯救效应的差异明确HL对训练之拯救效应的抑制。最后，采用类似分析明确HL对学习记忆即刻早基因表达的影响。
　　结论:
　　本研究利用高强度噪声短时暴露迅速建立了双侧中-重度HL小鼠模型。在噪声暴露后一周内未发现噪声组和对照组之间海马干细胞库和新生细胞数量的明显差异，说明本实验所用短期噪声的应激反应不影响海马干细胞库和细胞新生能力。在HL建立后3个月发现在NIHL动物有如下缺陷:(1)空间学习和记忆能力明显低于同龄对照动物;(2) MWM对海马神经新生的促进效应减弱，包括新生细胞存活减少，其分化为成熟神经元的比例显著降低，参与认知活动的神经元数量减少，海马中与学习相关的多个基因的表达明显低于对照;(3)神经元树突分枝数量及树突总长度显著减少。
　　以上实验结果提示:本实验所用NIHL导致动物海马相关空间认知功能的减退，海马细胞新生下降，该效应与应激反应无关。虽然所检测的空间认知与听觉没有直接关系，但是听觉输入的减少可能影响海马的整体功能，导致海马神经新生相关指标（细胞增殖、存活、神经元分化及神经网络整合）降低，学习训练对新生细胞的拯救效应减弱;学习训练不能有效诱导海马内学习记忆相关即刻早基因的表达等等。HL动物学习相关基因表达的缺陷可能是其学习相关海马神经新生的晚期过程（包括神经元的分化、以及树突分枝复杂度所代表的神经网络形成）缺陷的始动机制。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

第二章 文献综述

2．1 海马神经新生和标记技术

2．2 海马相关学习记忆训练／测试方法

2．3 学习记忆训练对海马神经新生的影响

2．4 听觉通路与智力相关脑区的联系

2．5 噪声性听力损失与海马相关认知功能障碍

2．5．1 噪声与感音神经性聋

2．5．2 噪声性应激与海马相关认知功能减退

2．5．3 噪声性听力损失与海马相关认知功能障碍及神经新生

2．5．4 神经元树突分枝与海马学习记忆功能的关系

2．5．5 海马学习记忆相关基因调控

2．6 小结

第三章 材料与方法

3．1 主要试剂与仪器

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器

3．2 实验设计分组与技术路线

3．3 主要实验方法

3．3．1 噪声暴露

3．3．2 听觉功能测试

3．3．3 Morris水迷宫训练／测试

3．3．4 海马神经新生观察

3．3．5 神经元树突分枝形态检测

3．3．6 基因表达的检测

3．4 统计学处理

第四章 结果

4．1 噪声暴露所致动物听觉阈值改变

4．2 噪声暴露对海马DG区干细胞库及新生细胞数目的影响

4．3 噪声性听力损失对小鼠MWM空间学习与记忆行为的影响

4．4 噪声性听力损失对海马DG区神经新生的影响

4．4．1 噪声性听力损失对海马新生细胞存活及学习拯救效应的影响

4．4．2 噪声性听力损失对海马DG区新生细胞神经元分化的影响

4．4．3 海马新生神经元参与空间学习记忆的程度

4．4．4 噪声性听力损失对海马DG区神经元树突分枝的影响

4．5 噪声性听力损失对海马学习记忆相关基因mRNA水平的影响

第五章 讨论

5．1 本研究主要发现

5．2 噪声性听力损失小鼠模型的建立

5．3 急性噪声暴露对海马干细胞库影响的排除

5．4 噪声性听力损失对海马相关空间学习记忆的影响及可能机制

5．4．1 噪声性听力损失对海马神经新生的影响

5．4．2 噪声性听力损失动物参与认知活动的神经元数量减少

5．4．3 噪声性听力损失动物海马DG区神经元树突形态可塑性的变化

5．4．4 噪声性听力损失动物海马学习记忆相关基因表达减少

5．5 本研究的局限性及后续发展方向

第六章 结论

致谢

参考文献

作者简介