血浆microRNA用于肝癌早期诊断的分子流行病学研究

摘要

肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，全球每年约有782，000新发病例。作为病死率第二位的恶性肿瘤，肝癌每年致746，000人死亡，其中一半以上的死亡病例发生在中国。乙肝病毒（Hepatitis B Virus，HBV）的感染是目前肝癌的主要的危险因素。由于缺乏用于肝癌早期诊断的灵敏特异的生物标志物，肝癌患者常常错过最佳治疗期，临床预后较差。目前最常见的用于肝癌诊断的生物标志物为甲胎蛋白(Alhpa Feto Protein，AFP)，但其在肝癌早期诊断中的价值较为有限。因此，寻找出新型的、高效的生物标志物用于肝癌的早期诊断对于提高肝癌患者的治疗效果及预后状况具有重要意义。本研究主要内容包括：
　　⑴利用TaqMan低密度表达芯片(TaqMan Low Density Array，TLDA)，1.组织样本:(1)分别检测HBV阳性的肝癌患者的肝癌组织、癌旁组织以及HBV阳性的肝炎肝硬化患者的肝炎组织（4例HBV阳性的肝癌病例和1例肝炎肝硬化病例）中miRNAs的表达谱，通过两两比较差异表达的miRNAs，即为组织中与肝癌相关的miRNAs;2.血浆样本:(1)分别检测HBV阳性的肝癌患者术前的血浆与HBV阳性的肝炎肝硬化患者术前血浆中的miRNAs的表达谱，筛选出与肝癌相关的miRNAs（4例HBV阳性的肝癌患者术前血浆和1例肝炎肝硬化患者术前血浆）;(2)分别检测HBV阳性的肝癌患者术前血浆与HBV阳性的肝癌患者术后血浆（4例HBV阳性的肝癌病例术前血浆与1例HBV阳性的肝癌病例切除术后血浆）中的miRNAs表达谱，筛选出肝脏起源的miRNAs;(3)分别检测HBV阳性的肝癌患者肝癌移植术前的血浆与移植术后血浆（3例HBV阳性的肝癌患者肝癌移植术前和移植术后的血浆）中的miRNAs的表达谱，将在肝脏移植术后患者血浆中表达上调的miRNAs剔除;通过上述策略，最终筛选出由肝脏起源的，与肝癌相关的10个循环miRNAs（miR-19a-3p、miR-19b-3p、miR-20a-5p、miR-25-3p、miR-30a-5p、miR-92a-3p、miR-132-3p,miR-185-5p、miR-320a和miR-324-3p）（在肝癌或对照中表达CT值低于35，且表达差异4倍以上）。
　　⑵通过对单个血浆样本（患者/对照）进行实时定量PCR(RT-PCR)检测10个miRNAs的表达情况，验证初筛的miRNAs;分为两个部分(1)第一部分:在35例HBV阳性的肝癌患者及在年龄与性别匹配的50例HBV感染者的血浆中检测miRNA表达水平，发现上述的10个miRNAs在HBV阳性的肝癌患者血浆中表达水平均高于对照组(P＜0.05)，由于其中四个miRNAs（miR-19a-3p、miR-19b-3p、miR-20a-5p和miR-92a-3p）均位于肿瘤miRNA17-92簇中，且两个miRNAs（miR-19a-3p和miR-19b-3p）与miR-20a-5p存在显著相关。因此，在第二部分仅检测了8个miRNAs(miR-20a-5p、miR-25-3p、miR-30a-5p、miR-92a-3p、 miR-132-3p、miR-185-5p、miR-320a和miR-324-3p)(2)第二部分:在32例HBV阳性的肝癌患者及32例HBV感染者的血浆中检测8个miRNAs的表达水平，检测发现这8个miRNAs在HBV阳性的肝癌患者血浆中的表达水平均显著高于对照组（所有P＜0.05）。为了进一步评价上述8个miRNAs在肝癌诊断中的应用价值，我们基于上述样本（即35例HBV阳性的肝癌患者和50例HBV感染者）进行参数估计，根据受试者工作特征曲线(Receiver OperatorCharacteristic Curve，ROC)来确定各个miRNA的最佳诊断界值，在确认最佳诊断临界值后，进行风险评分(s=0/1).根据Logistic回归分析的回归方程中的回归系数来确定各个miRNA在miRNAs组合中的权重，以风险评分为基础以及各自对应的miRNA权重来对每例样本的危险分值(RSF)进行估计。结果显示，上述的8个miRNAs组合的AUC为0.823（灵敏度82.9％，特异度74.0％）。然后，应用第二阶段第一部分确定的最佳诊断界值在第二阶段的第二部分样本中评价了8个miRNAs的诊断价值，该阶段的结果显示8个miRNAs组合的AUC为0.780（灵敏度78.1％，特异度68.7％）;两部分合并的AUC为0.802（灵敏度86.6％，特异度74.0％）。
　　⑶为了探讨筛选出的miRNA是否具有早期诊断的价值，我们进行了巢式病例对照研究。两个前瞻性队列分别位于江苏常州以及江苏启东。其中江苏常州队列，截止2013年11月，有20例HBV阳性的肝癌患者，我们在队列中选取了基线资料匹配的40例HBV感染者为对照;江苏启东队列截止2003年12月，有667例HBV阳性的肝癌患者，随机选取其中50例作为病例组，在未发病HBV感染者中随机选取37人作为对照。在上述总计147例样本中检测了11个miRNAs的表达情况（8个miRNAs以及文献报道且与我们TLDA芯片筛选结果方向一致的3个miRNAs分别为miR-192-5p、miR-21-5p和miR-375）。采用meta分析合并两个队列的数据，发现其中4个miRNAs（miR-20a-5p、miR-320a、miR-324-3p和miR-375）在肝癌患者中的表达水平显著高于对照(Pmeta＜0.05)。为了进一步评价筛选出的这4个miRNAs(miR-20a-5p、miR-320a、miR-324-3p和miR-375)在肝癌早期诊断中的价值。我们联合AFP结果，在常州队列和启东队列中分别利用ROC曲线确定每一个miRNAs及AFP的最佳临界值，然后对每一个个体的表达值进行风险评分，同样利用ROC曲线确定最佳临界值，以最佳临界值为依据将个体评为危险1或者不危险0。使用Logistic回归分析对每个miRNA与肝癌发病的关联进行评估。我们发现，4个miRNAs在常州队列中的AUC为0.768（灵敏度65.0％，特异度77.5％，阳性预测值59.1％，阴性预测值81.6％），AFP的AUC为0.575（灵敏度15.0％，特异度100.0％，阳性预测值100.0％，阴性预测值70.2％）;miRNAs与AFP合并的AUC为0.789（灵敏度70.0％，特异度77.5％，阳性预测值60.9％，阴性预测值83.3％）;在启东队列中，4个miRNAs的AUC为0.706（灵敏度56.0％，特异度83.3％，阳性预测值82.4％，阴性预测值58.5％），AFP的AUC为0.579(灵敏度16.0％，特异度100.0％，阳性预测值100.0％，阴性预测值46.8％);miRNAs与AFP合并的AUC为0.767（灵敏度64.0％，特异度83.8％，阳性预测值84.2％，阴性预测值63.3％）。
　　⑷本次研究利用肝脏组织与血浆样本共同筛选，得到来源于肝脏且与肝癌相关的10个血浆miRNAs。在肝癌的诊断方面，我们发现其中8个miRNAs在HBV阳性的肝癌患者中显著高表达，通过评估诊断价值后，发现这8个血浆miRNAs具有较好的诊断价值。在早期诊断方面的，通过巢式病例-研究对照研究，在两个独立的队列中验证得到4个具有早期肝癌诊断价值的血浆miRNAs。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

一、研究设计

二、研究对象

三、流行病学调查

四、实验方法

五、统计分析的方法

结果

一、研究对象的一般特征

二、筛选起源于肝脏的肝癌差异表达血浆miRNAs

三、独立样本验证差异表达的血浆miRNAs

四、评价血浆miRNAs在肝癌检测中的应用价值

五、评价候选miRNAs的早期诊断价值

讨论

总结

参考文献

综述 循环microRNA与肝癌的研究进展

附录一 主要缩略词中英文对照

附录二 发表论文

致谢