单纯性室间隔缺损胎儿羊水多肽组学分析及其自然闭合影响因素的研究

摘要

室间隔缺损(VSD)是心脏最常见的先天畸形之一，约占所有先天性心脏异常的40％。VSD的发生率大约为每1000名活产儿中有1.35～17.3例，先天性心脏疾病也给家庭和社会造成了沉重的经济压力和心理负担。随着分子生物学技术的发展，研究者们对心脏发育的分子机制获得了许多重要成果。特别是一些转录因子(TF)，例如NKX2.5、GATA4、TBX5、和HOMEZ已被确定为心脏发育过程中必不可少的。根据遗传学中心法则，蛋白质是基因功能的最终执行者，能显示基因翻译后修饰的细节。多肽组学的主要内容是研究内源性产生的蛋白质水解片段，是蛋白质组学的一个新兴的分支学科。多肽组学可以呈现研究样本健康状况的动态变化，内源性多肽可以直接与靶细胞相互作用，产生功能效应。因此，心血管系统相关的蛋白质组学、多肽组学大大拓宽了我们对心血管系统复杂生理和病理状态的认知范围，对于迅速推进发病机制的研究有着巨大价值。
　　近年来，随着胎儿超声心动图技术水平的不断发展、超声仪器设备的更新换代，人们已经可以在胎儿期和婴儿期准确地诊断和定位室间隔缺损。以往研究报道室间隔缺损存在一定概率的自然闭合，受到调查人群、诊断标准、检测方法、随访时间及室间隔缺损类型等诸多因素影响，自然闭合率波动于6％～71％。目前国内尚无大样本量的孕期发现室间隔缺损产后自然闭合情况的随访调查。本研究第二部分旨在通过分析胎儿超声心动图检查信息、婴儿出生时信息，结合出生后转归情况的随访，评估室间隔缺损自然闭合的发生率，希望能总结出一些室间隔自然闭合的影响因素。通过统计学分析得出室间隔缺损自然闭合率的预测公式，给产前咨询和预后判断一些有实用价值的参考。
　　本文主要从以下几方面进行论述：
　　第一部分 室间隔缺损胎儿羊水多肽组学的分析
　　目的:
　　1)检测室间隔缺损胎儿与正常对照之间羊水的内源性多肽表达谱;
　　2)筛选与心脏发育异常相关的生物活性多肽，为后续功能研究提供基础。
　　方法:
　　1)以胎儿心脏超声诊断为室间隔缺损的人孕23-25周羊水样本为实验组，孕周匹配、非疾病因素人工流产的正常胎儿羊水为对照组，采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)联合串联质谱标记法(TMT)检测两组之间内源性多肽的表达情况，对原始数据去冗余后进行统计分析，以差异倍数1.5倍以上且变化具有统计学意义（P＜0.05）为标准，筛选出差异表达的多肽;
　　2)分析差异表达多肽的理化性质、酶切位点、是否位于前体蛋白功能结构域之内;结合其对应前体蛋白IPA通路分析、GO分析，最终筛选出与心脏发育相关的多肽;
　　3)满足上述步骤筛选出心脏发育相关的多肽作为目标多肽，将对应的室间隔缺损及正常对照的母亲外周血血清采用高分辨率多反应监测体系（HR-MRM）对目标多肽进行追踪，验证羊水数据的可靠性及其与外周血多肽的相关性;
　　4)依据序列保守性、组织特异性等标准，筛选出与心脏发育可能最密切相关的多肽;对筛选出的多肽进行生物信息学分析，预测潜在的酶学功能改变。
　　结果:
　　1)对质谱数据进行标准化处理后对比两组结果，可以定量的多肽有692条，差异表达的多肽有183条，其中上调69条，下调114条;与心脏发育相关且位于其前体蛋白结构域内的多肽35条;
　　2)HR-MRM母亲外周血验证结果与胎儿羊水结果发现有12条多肽均有表达且趋势一致;
　　3)来自NOTC4的YSGPTCH和来自CO5A1的PGAPLLPPLLL这两条多肽在心脏组织/心肌细胞中特异度较高;且具有较好的物种保守性;
　　4)生物信息学分析显示来自NOTC4的YSGPTCH参与了Notch信号通路的组成部分，与胚胎心脏发育密切相关;且其酶切位点显示这一差异多肽的产生与基质金属蛋白酶-2和-9的活性改变相关。
　　结论:
　　1)与正常对照相比，室间隔缺损患儿羊水中的内源性多肽表达谱发生了显著变化，提示多肽可能参与调节心脏发育的过程。
　　2)经HR-MRM方法验证，羊水质谱结果可靠，可用于后续分析。
　　第二部分 室间隔缺损自然愈合影响因素的研究
　　目的:
　　1)通过对孕中期胎儿超声心动图确诊为单纯性室间隔缺损患儿及其母亲的随访调查，总体描绘出江苏地区室间隔缺损胎儿出生后的转归情况，找出VSD自然愈合的影响因素。
　　2)为产前咨询及临床决策提供依据，减少出生缺陷，提高人口素质;为出生后VSD患儿的预后判断提供参考。
　　方法:
　　1)2011年1月至2013年12月在胎儿超声心动图检查室所有检查出存在结构性先天性心脏病的患儿，从中筛选出单纯性室间隔缺损的胎儿及母亲。胎儿心脏彩超采用Acuson Sequoia512型彩色超声诊断系统，配有内置数字超声工作站。
　　2)超声数据包括孕妇姓名、年龄、检查时间孕周、联系电话、胎心率、主肺动脉直径、心房心室大小、房室瓣、主肺动脉瓣有无返流;室间隔缺损位置、缺损大小、缺损处分流情况。结合遗传学检验结果（羊水穿刺、脐带血穿刺），统计存在染色体数量及结构异常的患者。
　　3)随访问题包括目前缺损有无闭合、闭合时年龄、未闭合者治疗方式、性别、出生体重、有无早产、孕期有无感染或代谢性疾病、有无心脏病家族史。
　　4)统计学方法采用SPSS14.0统计软件分析:定性资料采用交叉表分析、定量资料采用ANOVA方差分析、危险因素分析采用二元logistic回归、缺损大小与是否愈合的截断值选择采用ROC曲线。
　　5)2014年1月至3月出生的患儿随访后的实际结果与二元logistic回归预测公式计算P值相比较，验证公式的实用价值。
　　结果:
　　1)初始随访患者共423人，有效随访257人，44人引产，213人出生。出生后死亡8人、存活205人。截至随访时，19人手术，24人未闭合，110人自然闭合（49人孕期闭合，61人产后闭合）。
　　2)将产后死亡、手术及未闭合的患儿归入未闭合组，加上孕期闭合组和产后闭合组，共分为3组，比较三组间孕期B超数据及产后随访结果，存在统计学差异(P＜0.05)数据有:缺损直径(3.422±0.972，2.426±0.599，2.292±0.479mm)、出生体重（3.095±0.774，3.174±0.535，3.499±0.532kg）、缺损位置、缺损处分流方向。平均闭合时间为7.31±6.073月。以是否愈合为状态变量，缺损直径为检验变量，曲线下面积为0.842，Cut-off值:2.55mm。此时敏感度:0.800，特异度:0.718。二元logistic回归显示排除缺损位置影响后，出生体重为缺损愈合的保护因素，缺损直径为缺损愈合的危险因素。
　　3)进而又根据二元logistic回归预测概率公式P=(1+ EXP-[-2.151-0.716*出生体重+1.393*直径])-1。检验2014年1月至3月出生的患儿，23位患儿中19位与预测结果一致。暂无统计学差异的数据有母亲年龄、胎儿主动脉直径、肺动脉直径、胎心率以及孕期母亲疾病情况。
　　结论:
　　1)利用统计学分析，找到孕中期检查出室间隔缺损患儿出生后缺损是否可以闭合的缺损直径截断值为2.55mm，缺损越小越容易闭合;
　　2)出生体重大者自然愈合概率较高;
　　3)男性胎儿自然愈合的概率较高;肌部缺损愈合概率较高;缺损处未探及穿隔血流者易愈合;足月生产婴幼儿愈合概率较高。

目录

声明

摘要

前言

参考文献

第一部分 室间隔缺损患儿羊水的多肽组学分析

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 室间隔缺损患儿自然闭合影响因素的研究

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

中英文缩略语

综述一 多肽组学在心脏发育和心血管内疾病中的研究进展

综述二 胎儿室间隔缺损的发生及自然愈合影响因素

一、博士期间已发表论文

二、博士期间已投稿论文

三、会议投稿和发言

四、博士期间获奖情况

五、博士学习期间参与的课题

致谢