TCF21基因多态性与中国汉族女性乳腺癌发病风险的关联研究及功能分析

摘要

第一部分 TCF21基因在乳腺癌中的表达及其功能
　　目的:检测TCF21基因在人乳腺癌细胞和组织中的表达，并分析其表达与乳腺癌临床病理特征及预后的关系，同时观察TCF21基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响。
　　方法:(1)通过实时定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测TCF21基因在人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7，人正常乳腺上皮细胞MCF-10A和39例术后乳腺癌组织及其癌旁正常组织中的表达，并分析癌组织中TCF21 mRNA表达与临床病理特征的关系。(2)利用生物信息软件KM-plotter分析乳腺癌组织中TCF21 mRNA表达与预后的关系。(3)采用脂质体介导法将重组质粒pcDNA3.1-TCF21和空质粒pcDNA3.1分别转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞，并运用RT-qPCR和Westernblot方法检测质粒转染后细胞中TCF21基因的表达情况。(4) CCK-8法和AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法分别被用于检测TC F21基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响。
　　结果:(1)乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞中TCF21 mRNA和蛋白的表达水平均显著低于正常乳腺上皮细胞MCF-10A。随后采用同样的方法检测39例人乳腺癌组织及其癌旁正常组织中TCF21 mRNA的表达，结果显示TCF21mRNA在36例乳腺癌组织中低表达，在1例乳腺癌组织中表达无差异，在2例乳腺癌组织中高表达。对TCF21mRNA低表达的乳腺癌组织进行Western blot检验，发现TCF21蛋白在乳腺癌组织中的表达水平也显著低于癌旁正常组织，与mRNA检测结果一致。通过进一步分析乳腺癌组织中TCF21 mRNA表达水平与临床病理特征的关系，我们发现TCF21 mRNA表达水平与患者年龄、TNM分期、肿瘤分化程度、ER、PR及HER2的表达无关，但与肿瘤大小、淋巴结转移有关。TCF21 mRNA低表达更容易发生在大尺度肿瘤和淋巴结转移阳性的肿瘤中。(2) KM-plotter分析结果显示乳腺癌组织中TCF21 mRNA表达水平与患者总生存率无关，但与患者无复发生存率有关。与TCF21 mRNA高表达患者相比，TCF21 mRNA低表达患者的无复发生存率显著降低(P=4.7e-07)。(3)重组质粒转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后，细胞内TCF21 mRNA和蛋白的表达量明显增加。(4)与对照组相比，TCF21基因过表达不仅能抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖，还能促进细胞凋亡。
　　结论:TCF21基因作为抑癌基因在人乳腺癌细胞及大多数乳腺癌组织中低表达，并且TCF21基因低表达与乳腺癌淋巴结转移、肿瘤体积增大及不良预后有关。进一步体外实验证实TCF21基因过表达能够抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖并促进其凋亡。
　　第二部分 TCF21基因多态性与中国汉族女性乳腺癌发病风险的关系及其机制
　　目的:研究TCF21基因标签单核苷酸多态性(tag single nucleotidepolymorphisms，tagSNPs)与中国汉族女性乳腺癌发病风险的关系，并利用基因型-表型关联分析及体外细胞实验研究差异多态性位点参与乳腺癌发生的分子机制。
　　方法:(1)利用Haploview4.2软件从HapMap数据库中获取中国汉族人群TCF21基因tagSNPs。(2)采用多重聚合酶链反应-连接酶检测反应技术对901例乳腺癌患者（病例组）和1225例健康个体（对照组）TCF21基因tagSNPs进行分型，并运用拟合优度卡方检验分析对照组中各多态性位点基因型分布是否符合哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）。(3)利用logistic回归模型分析TC F21基因tagSNPs与中国汉族女性乳腺癌发病风险的关系。(4)通过RT-qPCR方法检测乳腺癌组织和癌旁正常组织中TCF21 mRNA的表达，并使用单因素方差分析检测差异多态性位点(rs12190287 C＞G)基因型与TCF21mRNA表达量的关系。(5)鉴于rs12190287位点位于TCF21基因3'非翻译区(3'untranslated region，3'UTR)，生物信息学软件TargetScan和miRanda被用于预测与该多态性位点结合的特异miRNA。(6)采用RT-qPCR方法检测乳腺癌细胞及组织中特异miRNA的表达。(7)通过直接测序法检测乳腺癌 MDA-MB-231细胞中rs12190287位点基因型。(8)使用miRecords软件和TSGene数据库获取乳腺癌中特异miRNA的潜在靶基因。(9)化学合成特异miRNA mimic和inhibitor，并通过功能获得性研究和功能缺失性研究分析乳腺癌MDA-MB-231细胞中特异miRNA对TCF21基因及其潜在靶基因（SMAD4，PPP2R1B, GGNBP2，NUAK1）表达的影响。(10)采用DNA重组和定点突变技术构建pmirGLO-TCF21-3'UTR-C和pmirGLO-TCF21-3'UTR-G双荧光素酶报告基因载体，分析rs12190287位点不同等位基因对特异miRNA发挥调控作用的影响。
　　结果:(1)利用Haploview4.2软件和HapMap数据库从TCF21基因中获得6个tagSNPs(rs2327429 T＞C, rs2327430 T＞C, rs2327433 A＞G, rs12190287C＞G, rs7766238 G＞A, rs4896011 T＞A)，其中2个tagSNPs(rs2327429 T＞C,rs2327430 T＞C)位于基因启动子区，1个tagSNP(rs2327433 A＞G)位于基因内含子区，3个tagSNPs(rs12190287 C＞G，rs7766238 G＞A，rs4896011 T＞A)位于基因3'UTR。(2)基因分型结果表明，对照组中tagSNPs位点基因型频率分布均符合HWE:rs2327429位点的PHWE值为0.61，rs2327430位点的PHWE值为0.79，rs2327433位点的PHWE值为0.74，rs12190287位点的PHWE值为0.94，rs7766238位点的PHWE值为0.06，rs4896011位点的PHWE值为0.08。(3)病例对照研究结果显示，TCF21 rs12190287位点多态性与中国汉族女性乳腺癌发病风险有关(G vs.C，OR=0.80，95％CI=0.71-0.91，P=0.001; GG vs.CC，OR=0.64，95％CI=0.49-0.84,P=0.001; CG vs.CC, OR=0.81,95％CI=0.68-0.98,P=0.03; GG+ CG vs.CC, OR=0.77,95％CI=0.64-0.92, P=0.003; GG vs.CG+CC, OR=0.72,95％CI=0.56-0.92，P=0.007)。进一步基于年龄的分层分析结果表明，rs12190287位点多态性不仅与50岁以下女性乳腺癌发病风险有关(G vs.C，OR=0.85，95％CI=0.73-0.99, P=0.04; GG+CG vs.CC, OR=0.80,95％CI=0.64-0.99，P=0.04)，还与50岁及以上女性乳腺癌发病风险有关(Gvs.C，OR=0.72，95％CI=0.58-0.89，P=0.002; GG vs.CC, OR=0.52,95％CI=0.34-0.80, P=0.003; GG+CG vs.CC,OR=0.72,95％CI=0.54-0.97, P=0.03; GG vs.CG+CC, OR=0.58,95％CI=0.39-0.86,P=0.01)。基于病理类型的分层分析结果表明，TCF21 rs12190287位点多态性只与乳腺浸润性导管癌的发病风险有关（Gvs.C，OR=0.78，95％CI=0.68-0.89，P＜0.001; GG vs.CC, OR=0.59,95％CI=0.45-0.79, P＜0.001; CG vs.CC, OR=0.82,95％CI=0.67-0.99, P=0.04; GG+CG vs.CC, OR=0.76,95％CI=0.83-0.91, P=0.003;GG vs.CG+ CC，OR=0.67，95％CI=0.51-0.86，P=0.002）。基于肿瘤期的分层分析结果表明，rs12190287位点多态性不仅与I+II期乳腺癌发病风险有关(G vs.C，OR=0.80,95％CI=0.70-0.92,P=0.002; GG vs.CC, OR=0.59,95％CI=0.44-0.80,P=0.001; GG+CG vs.CC, OR=0.79,95％CI=0.65-0.96,P=0.02; GG vs.CG+CC,OR=0.64，95％CI=0.49-0.85，P=0.002），还与Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌发病风险有关(G vs.C, OR=0.79,95％CI=0.65-0.97, P=0.03; GG vs.CC, OR=0.66,95％CI=0.44-0.99,P=0.05; CG vs.CC, OR=0.57,95％CI=0.41-0.79,P=0.001; GG+CG vs.CC,OR=0.60，95％CI=0.44-0.80，P=0.001）。(4)基因型-表型关联分析显示，癌旁正常组织中rs12190287位点基因型与TCF21 mRNA表达量相关。与rs12190287CC基因型癌旁正常组织相比，GG基因型癌旁正常组织中TCF21 mRNA表达量显著增加。(5)生物信息学分析结果表明，rs12190287位点位于hsa-miR-224与TCF21 mRNA3'UTR结合的种子区域，其中rs12190287 C等位基因有助于hsa-miR-224对TCF21基因表达的调控。(6)RT-qPCR检测结果表明hsa-miR-224在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达水平显著高于正常乳腺上皮细胞MCF-10A。通过检测30例乳腺癌组织及其癌旁正常组织中hsa-miR-224的表达，发现hsa-miR-224在14例乳腺癌组织中高表达，在7例乳腺癌组织中表达无差异，在9例乳腺癌组织中低表达。(7)测序分型结果表明乳腺癌MDA-MB-231细胞中rs12190287位点基因型为CC纯合子，提示hsa-miR-224可能参与调控乳腺癌MDA-MB-231细胞中TCF21基因的表达。(8)进一步生物信息学分析结果表明，hsa-miR-224也可能参与调控乳腺癌MDA-MB-231细胞中SMAD4，PPP2R1B，GGNBP2和NUAK1基因的表达。(9)功能获得性研究结果表明，hsa-miR-224过表达能够显著抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞中TCF21、PPP2R1B、GGNBP2和NUAK1基因mRNA的表达。功能缺失性研究结果表明，hsa-miR-224抑制能够显著上调乳腺癌MDA-MB-231细胞中TC F21和GGNBP2基因mRNA的表达。(10)双荧光素酶活性分析结果表明，rs12190287G等位基因能够干扰hsa-miR-224与TCF21 mRNA3'UTR的结合，从而增加TCF21基因的表达。
　　结论:TCF21基因3'UTR中的rs12190287位点多态性与中国汉族女性乳腺癌发病风险有关。与携带有rs12190287 C等位基因的个体相比，携带有G等位基因的个体患乳腺癌的风险显著降低。进一步功能研究表明，rs12190287 G等位基因能够干扰hsa-miR-224对TCF21基因表达的调控。因此该多态性位点可能作为中国汉族女性乳腺癌发病风险的生物标记物，鉴定该多态性位点将有助于实施明确的个体化预防、干预及治疗。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词表

前言

第一章 文献综述

第二章 TCF21基因在乳腺癌中的表达及其功能

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二节 TCF21基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章 TCF21基因多态性与中国汉族女性乳腺癌发病风险的关系及其机制

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二节 差异多态性位点(rs12190287)参与乳腺癌发生的分子机制

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文总结与展望

参考文献

作者简介

致谢