短期禁食调控Sirt1-自噬通路在肝脏缺血再灌注损伤中的作用及相关机制研究

摘要

肝脏缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury,IRI)是肝脏疾病发展过程中一种非常复杂的病理生理过程，其相关影响因素有很多。能量限制或饥饿（禁食）有利于延长寿命和增强抗压力，研究证实，能量限制在包括肝脏的许多脏器缺血再灌注损伤中也起到保护性作用。但是确切的内在机制仍尚不清楚。本组的前期研究证实对正常的野生小鼠短期禁食（short-term starvation，STS）预处理后，建立肝脏的缺血再灌注模型，复灌6小时后提取小鼠血清，进行炎症因子检测。与对照组检测结果相比而言，预处理组小鼠促炎因子TNF-α、IL-6释放降低，抗炎症因子IL-10释放提高，然而其中确切的分子机制有待进一步研究。预实验显示用短期禁食预处理可降低热缺血复灌后炎症因子基因的表达及其炎症因子的释放，并且在缺血复灌阶段Sirt1较对照组表达提高。因此，本课题旨在分析短期禁食预处理调控Sirt1自噬信号通路在肝脏IRI中的作用及机制。本课题的成功可首次证实短期禁食预处理可通过Sirt1自噬信号通路减轻肝脏IRI损伤，为减轻细胞凋亡及调节先天免疫炎症提供新的思路，为肝脏外科临床手术中肝脏IRI治疗提供新的治疗策略。总课题分为以下三个部分。 第一部分 短期禁食预处理减轻肝脏IR损伤 本组研究通过小鼠70%肝脏缺血90分钟，复灌6h建立小鼠肝脏IRI模型，取小鼠血清及肝脏组织标本行生化指标检测、病理组织学检测、TUNEL染色、caspase-3活性检测及qRT-PCR检测。 与Sham组相比，IR组小鼠血清ALT及AST值水平明显升高(P＜0.01)；相反地，STS+IR组小鼠分别禁食1天（1d-ST），2天（2d-ST）和3天（3d-ST），禁食期间仅能饮水，缺血复灌后1d-ST,2d-ST和3d-ST组小鼠的sALT和sAST水平显著低于对照组(P＜0.05)，特别是2d-ST和3d-ST组更明显(P＜0.01)。 病理学切片所呈现的趋势与肝血清生化数据符合。病理学切片显示，相对于假手术组，IR组可见严重的肝小叶坏死，肝细胞明显充血水肿，大规模的液化和坏死。所有这些病理变化在1d-ST,2d-ST和3d-ST组中均有显著改善。这些数据表明禁食1天，2天，3天都可以有效地减轻小鼠肝脏IRI，特别是禁食2天和3天更为明显。 取复灌后6h肝脏组织行TUNEL染色，各组TUNEL阳性细胞比例分别为：1d-ST组43.17±6.63%,2d-ST组17.50±3.63%,3d-ST组18.53±3.34%,，I/R组67.17±7.80%，提示STS显著抑制了肝细胞凋亡。在STS组中BCL-2,BCL-xl和P-Akt的表达显著高于I/R组。而且2d-ST和3d-ST组中BCL-2,BCL-xl和P-Akt的表达要高于1d-ST组，但是2d-ST组和3d-ST组之间没有显著差异。与抗凋亡蛋白相反，凋亡蛋白cleaved capase-3的活性在禁食组中被显著地抑制了。由此可见，体内实验表明短期禁食预处理可减轻肝脏IRI损伤，减轻炎症反应及细胞凋亡，特别是禁食2天和3天更显著。 第二部分 短期禁食预处理通过增强自噬减轻肝脏IR损伤 以往的研究证实，热量限制或禁食可以在许多脏器中诱导细胞自噬。在脑、心脏、肾脏和肝脏中，自噬可能对抗IRI，起保护作用。为进一步明确禁食能否引起肝脏细胞自噬增加，减轻肝IR损伤。我组对禁食2天的小鼠肝组织进行Western Blot检测，测量肝脏中细胞自噬的标志蛋白LC3B和P62。如同预计的一样，与对照组相比，饥饿2天显著增加了LC3B的表达(2.38±0.23vs.1.00±0.13;P<0.01)，同时减少了P62的表达(0.50±0.07vs.1.00±0.15;P＜0.05)。为了进一步证实Western Blot结果，我们进一步进行了LC3B免疫荧光染色来测量自噬体活性，发现与对照组相比，禁食明显地增强了LC3B免疫荧光染色。 我组进一步对2d-ST组小鼠注射了3-甲基腺嘌呤(3-MA)以阻断自噬表达。结果发现禁食2天显著减轻了IR导致的sALT升高(8824.2±2470.6vs.876.4±129.2;P＜0.01)，但是在注射了3-MA后，sALT就再次升高了(4821.3±946.2vs.876.4±129.2;P＜0.01)。与之一致，HE染色显示饥饿2天有效减轻了IR引起的肝组织水肿，肝窦淤血，结构损坏和肝细胞坏死，但是3-MA处理阻断了这一效果(Figure4B,4D)。IR,ST+IR,和3-MA+ST+IR组的Suzuki评分分别为3.6±0.3,1.5±0.2,和3.2±0.3。我们进一步通过TUNEL染色分析了缺血肝脏中肝细胞坏死的情况(Figure4C,4D)，结果进一步证实3-MA几乎完全逆转了饥饿减少的TUNEL阳性细胞比例。在IR,ST+IR,和3-MA+ST+IR组，TUNEL阳性细胞比例分别为60.17±7.36%,24.00±3.51%,和54.33±5.89%。总体来说，以上发现证实自噬在STS介导的抗肝IRI保护作用中起决定性作用。 第三部分 短期禁食预处理通过Sirt1自噬通路保护肝脏减轻IR损伤 在一些器官中，热量限制或禁食能诱导Sirt1的表达。Sirt1在禁食诱导的自噬中可能是一个重要的因素。但是在禁食引起的肝脏自噬增加中，是否经由Sirt1信号通路调控尚无相关研究报道。本组首先通过PCR检测了小鼠肝组织中Sirt1的mRNA表达，结果发现在禁食1天，2天和3天预处理后，Sirt1mRNA的表达分别是对照组的1.6倍，2.5倍和2倍。以Western Blot检测Sirt1蛋白表达，发现Sirt1蛋白表达在禁食2天和3天后显著增加。 我们在禁食前和禁食期间给小鼠注射sirtinol（一种Sirt1抑制剂），再检测缺血复灌6h的肝组织中LC3B和P62的表达。结果发现，sirtinol有效地抑制了STS引起的肝组织中LC3B的表达并恢复了P62的表达。LC3B免疫组织学染色发现，I/R组镜下可见少量自噬体，而ST组自噬体数量明显增加，经过sirtinol处理后，镜下可见肝组织内自噬体分布与I/R组相似。HE染色也显示sirtinol处理组的组织学损伤与I/R组类似。通过检测sALT和sAST水平，发现sirtinol使禁食降低的sALT(P＜0.01)和sAST(P＜0.01)水平再次升高。这些结果提示在STS所致的抗肝IRI保护作用，是通过Sirt1信号通路调控的。

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常用中英文对照

第一部分 短期禁食预处理减轻肝脏IR损伤

第二部分 短期禁食预处理通过增强自噬减轻肝脏IR 损伤

第三部分 短期禁食预处理通过Sirt1自噬通路保护肝脏减轻 IR损伤

Abstract

引言

正文

第一部分 短期禁食预处理减轻肝脏IR损伤

第二节 体内研究短期禁食预处理保护小鼠肝脏抗IRI 凋亡作用

小 结

第二部分 短期禁食预处理通过增强自噬减轻肝脏IR 损伤

第一节 体内实验分析短期禁食对小鼠肝脏自噬的影响

第二节 体内实验研究自噬在短期禁食抗肝IR损伤中的作用

小结

第三部分 短期禁食预处理通过Sirt1自噬通道保护肝脏减轻 IR损伤

第一节 体内实验分析禁食对小鼠肝脏Sirt1表达的影响

第二节 体内实验研究Sirt1在短期禁食上调自噬及抗肝IR损伤中的作用

小结

总结

参考文献

Suzuki HI, Kiyono K and Miyazono K. Regulation of

细胞自噬与肝脏缺血再灌注相关研究进展

附录 实验所用试剂配方

攻读学位期间文章发表情况

致谢