钾离子通道Kir2.1/KCNJ2对大鼠血管平滑肌细胞表型转换的影响及调控机制

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 Kir2.1-shRNA慢病毒载体的构建包装及其对大鼠血管平滑肌细胞Kir2.1基因敲减效率的测定
　　目的：首先构建针对SD大鼠内向整流钾离子通道2.1（inwardly rectify K+channel2.1，Kir2.1）基因的特异性短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)表达的慢病毒(Lentivirus，LV)干扰载体，然后转染大鼠胸主动脉平滑肌细胞(rat thoracic aorta vascular smooth muscle cells，RASMCs)检测慢病毒对Kir2.1基因敲减的效率。
　　方法：根据GenBank公布的NM_017296.1序列确定四条针对Kir2.1基因cds区的小干扰RNA(small interfering，siRNA)序列(shRNA1-4)，同时设计一条阴性对照序列用于shRNA阴性对照(Negative Control，NC)，共组建与shRNA相对应的5条互补的单链DNA。慢病毒颗粒由包装质粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G和shRNA重组穿梭质粒组成，进行测序鉴定后，再转染293T细胞产生病毒液。RASMCs按照浓度5×105cells/mL被接种在6孔板，连同对照组(Control，CON)将细胞分为六组（shRNA1-4组、NC组、CON组），以Kir2.1-shRNA慢病毒(Kir2.1-shRNA-Lv)感染复数为(multiplicity of infection，MOI)100进行转染，120 h后使用荧光显微镜进行EGFP表达观察，并采用Western blot对五组进行Kir2.1的蛋白表达的检测。
　　结果：(1)成功构建含Kir2.1-shRNA的慢病毒载体;(2)为测定Kir2.1-shRNA-Lv在RASMCs内的转染效率，使用MOI=100转染120 h后，以荧光显微镜观察EGFP表达情况，在RASMCs内慢病毒载体的表达效率几乎达到了90％。(3)Western blot分析表明与对照组相比四条干扰病毒均明显抑制Kir2.1表达，其中sh-RNA3抑制效率最高，为最有效靶点组，而NC组与CON组内Kir2.1表达无明显差异。
　　结论：成功构建Kir2.1-shRNA-Lv载体，其中携带sh-RNA3的慢病毒对RASMCs具有高效转染效率并且抑制RASMCs内Kir2.1蛋白表达效果最好，可以作为后续实验的最佳病毒选择。
　　第二部分 Kir2.1-shRNA-Lv介导的Kir2.1基因沉默对PDGF-BB诱导的RASMCs增殖、迁移及表型蛋白影响的研究
　　目的：通过Kir2.1-shRNA-Lv敲减RASMCs中的Kir2.1基因，检测Kir2.1对血小板衍生生长因子BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB）诱导的RASMCs增殖、迁移及表型蛋白的影响。
　　方法：从大鼠胸主动脉中膜分离培养平滑肌细胞，通过Kir2.1-shRNA-Lv转染沉默Kir2.1，72 h后加入PDGF-BB(25ng/mL)干预24 h，采用CCK-8法和BrdU免疫荧光染色法检测RASMCs增殖的情况，通过划痕和transwell小室实验检测RASMCs迁移的情况，通过Western blot检测干预后RASMCs表型蛋白表达的变化，以探讨Kir2.1沉默对PDGF-BB诱导的RASMCs增殖、迁移及表型蛋白的影响。
　　结果：(1)与NC对照组相比，单纯PDGF-BB(25ng/mL)诱导组细胞增殖明显增加，敲减Kir2.1后对RASMCs进行PDGF-BB诱导的细胞增殖较单纯诱导组增殖显著减少。(2)与NC对照组相比，单纯PDGF-BB诱导组细胞迁移明显，敲减Kir2.1后对RASMCs进行PDGF-BB诱导的细胞迁移较单纯诱导组显著减少。(3)与NC对照组相比，单纯PDGF-BB诱导组细胞舒张表型蛋白(osteopontin)表达增加而收缩表型蛋白(SM22α、SMα-actin、calponin)表达减少，敲减Kir2.1后对RASMCs进行PDGF-BB诱导较单纯PDGF-BB诱导的收缩表型蛋白明显增加而舒张表型蛋白减少。
　　结论：Kir2.1沉默可以抑制PDGF-BB诱导的RASMCs增殖、迁移和表型转换。
　　第三部分 慢病毒介导的Kir2.1基因沉默对大鼠颈动脉球囊损伤新生内膜影响的研究
　　目的：通过Kir2.1-shRNA-Lv敲减在体大鼠颈动脉Kir2.1来观察其对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的影响。
　　方法：24只SD雄性大鼠随机分为假手术组（Sham组）、生理盐水组（Saline组）、Kir2.1-shRNA-Lv敲减组(KD组)、阴性病毒对照组(NC组)，成功构建颈动脉球囊损伤模型后在球囊侧孔分别各组注入100μL生理盐水、100μLKir2.1-shRNA-Lv病毒液、100μL阴性病毒液孵育30min，3周后取出损伤血管采用荧光显微镜及Western blot验证感染效率，HE染色分析内膜形态变化。
　　结果：(1)KD组和NC组荧光显微镜下可见绿色荧光的内膜和中膜形态;(2)与Sham组相比，Saline组和NC组Kir2.1蛋白表达明显增加，KD组的Kir2.1的表达较Saline明显减少;(3)与Sham组相比，Saline组和NC组新生内膜面积明显增加，KD组的新生内膜面积较Saline组显著减少，与Sham组相比，各组的中膜面积变化没有显著差异。
　　结论：Kir2.1-shRNA-Lv可以明显抑制在体RASMCs中Kir2.1的表达，并可以抑制大鼠球囊损伤后新生内膜的形成。
　　第四部分 Kir2.1参与调控PDGF-BB诱导的RASMCs表型转换的机制研究
　　目的：通过膜片钳技术来研究Kir2.1参与PDGF-BB诱导的RASMCs表型转换的调控机制
　　方法：使用PDGF-BB受体α(PDGF-BBRα)和β(PDGF-BBRβ)的抑制剂(AG1296和AG1295)、PI3K/AKt和cAMP-PKA信号通路抑制剂（GSK690693和Rp-8-CPT-cAMPs）、cAMP激动剂和抑制剂（Forskolin和SQ22536），对RASMCs进行干预，然后使用PDGF-BB(25ng/mL)诱导24 h，然后选择单个细胞，采用全细胞电压钳模式，使用protocol电压记录RASMCs的Kir2.1电流变化，Western blot检测PDGF-BB诱导后Kir2.1的表达。
　　结果：(1)膜片钳检测PDGF-BB诱导RASMCs后Kir2.1电流:与典型Kir2.1电流图(CON组)相比，加入Kir2.1通道抑制剂Ba2+后的电流显著被抑制，而单纯加入PDGF-BB诱导后的Kir2.1的电流较CON组增加;(2)与CON组相比，PDGF-BB诱导组的Kir2.1蛋白表达显著增加;(3)膜片钳检测PDGF-BBRα抑制剂和PDGF-BBRβ抑制剂干预RASMCs后，PDGF-BB诱导的Kir2.1电流:与单纯PDGF-BB诱导组相比，PDGF-BBRα干预组的Kir2.1电流未见明显变化，而PDGF-BBRβ干预组的电流明显减小。(4)膜片钳检测AKt抑制剂干预RASMCs后，PDGF-BB诱导的Kir2.1电流:与单纯PDGF-BB诱导组相比，加入AKt抑制剂的Kir2.1电流未见明显变化。(5)膜片钳检测PKA抑制剂干预RASMCs后，PDGF-BB诱导的Kir2.1电流:与单纯PDGF-BB诱导组相比，加入PKA抑制剂的Kir2.1电流明显减少。(6)膜片钳检测cAMP激动剂和抑制剂干预RASMCs后，PDGF-BB诱导的Kir2.1电流:与单纯PDGF-BB诱导组相比，加入cAMP激动剂组的Kir2.1电流显著增加，加入cAMP抑制剂组Kir2.1电流显著减少。
　　结论：PDGF-BB可能通过作用其受体PDGF-BBRβ后，激活信号通路cAMP-PKA来促进Kir2.1电流增加，导致RASMCs发生表型转换。

目录

声明

摘要

本文所用缩略语注释表

前言

文献综述

第一部分 Kir2．1-shRNA慢病毒载体的构建包装及其对大鼠血管平滑肌细胞Kir2．1基因敲减效率的测定

1．1．前言

1．2．试剂与器材

1．3．主要实验方法

1．4．结果

1．5．讨论

1．6．结论

第二部分 Kir2．1-shRNA-Lv介导的Kir2．1基因沉默对PDGF-BB诱导的RASMCs增殖、迁移及表型蛋白影响的研究

2．2．试剂与器材

2．3．主要实验方法

2．4．结果

2．5．讨论

2．6．结论

第三部分 慢病毒介导的Kir2．1基因沉默对大鼠颈动脉球囊损伤新生内膜影响的研究

3．1．前言

3．2．试剂与器材

3．3．主要实验方法

3．4．结果

3．5．讨论

3．6．结论

第四部分 Kir2．1参与介导PDGF-BB诱导的RASMCs表型转换的机制研究

4．1．前言

4．2．试剂和器材

4．3．主要实验方法

4．4．结果

4．5．讨论

4．6．结论

全文总结及展望

参考文献

致谢

作者简介

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