A型肉毒素对UVB诱导提前衰老人真皮成纤维细胞长链非编码RNA表达的影响及其分析

摘要

研究背景及目的：
　　皮肤老化表现为皱纹形成、色沉增多、弹性下降等，受内源性因素和外源性因素的共同影响[1]。内源性因素导致的皮肤老化又称为自然老化，由遗传和不可抗力（如内分泌变化、免疫功能的下降等）导致，是机体自然衰老的体现之一，目前尚不可人为调控。造成皮肤老化的外源性因素有很多，如紫外线辐射、吸烟、不健康饮食、空气污染、睡眠质量差、化学物质刺激等，这些因素是可以人为控制的[2]。虽然相关机制尚未研究透彻，但目前研究已经证明，紫外线辐射是导致皮肤老化的主要因素，某种角度上来讲光老化即外源性老化的代称[3-5]。有关光老化机制及干预手段的研究一直是皮肤科领域的热点。
　　A型肉毒素(Botilium Toxin Type A，BoNTA)是肉毒杆菌分泌的七种神经毒素中最有效的一种，在临床得到广泛应用[6]。BoNTA可引起肌肉松弛，由于它这种肌肉松弛的特性可以使皱纹（主要是动态性皱纹）得到改善，现已成为皮肤科治疗外源性老化的重要手段之一[7.8]。2005年和2008年，一些研究人员发现在颜面的中下1/3处皮下注射BoNTA，可一定程度地提升面部曲线[9,10]。为了解BoNTA在改善皮肤状态中的真实效用，2012年，Sang-Ha Oh等研究了BoNTA对离体状态下对正常人真皮成纤维细胞(Human dermal fibrolasts，HDFs)的影响，得出BoNTA具有显著的提高胶原蛋白产生水平、降低其降解作用的结论[12]。2014年，本研究小组对于UVB所致光老化的HDFs进行了体外研究，得出了BoNTA可以有效提高COL-Ⅰ及COL-Ⅲ水平，减少MMP-1及MMP-9分泌的结论[13]。2016年，朱洁等证明了局部应用BoNTA可以增强二氧化碳(cnarbon dioxide，CO2)点阵激光术后的复原效果，进一步表明BoNTA可以改善皮肤质地，使皮肤变得更光滑[14]。这些研究不仅证明了BoNTA对HDFs在改善皮肤状态上的积极作用，而且也暗示了HDFs的重要性。
　　长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是一组长度大于200个核苷酸片段、不具有编码蛋白质的功能[15]。随着基因检测技术的进步和相关知识不断深入，以前被认为是转录“噪声”的LncRNA现在被证明具有一定的功能，lncRNA可通过调节基因组印记、染色体修饰、核转运、转录激活、干扰等来参与生物学过程[16,17]。在生理条件下对细胞功能的理解如果忽略了对lncRNAs所发挥的作用的分析，是不全面的。因此，我们将从研究UVB辐射对正常HDFs、BoNTA对正常HDFs及BoNTA对UVB诱导的提前衰老(UVBinduced premature senescence，UVB-IPS)HDFs中lnc-RNA表达的影响着手，研究原来被认为没有功能的lncRNA在光老化发生和BoNTA改善皮肤老化中的可能机制及作用环节。
　　研究方法：
　　1.各部分实验的分组
　　从包皮环切术后的皮肤分离培养的人真皮成纤维细胞(Human dermalfibrolasts，HDFs)，选处于对数生长期8-11代的正常HDFs，分别分组如下:
　　(1)第一部分:①对照组;②UVB诱导提前衰老成纤维细胞(UVB-IPS)组:UVB以10mJ/cm2大小能量连续照射5天，静置3天。用β-半乳糖苷酶验证两组细胞的衰老状况。
　　(2)第二部分:①对照组;②BoNTA处理组(2.5U48h):BoNTA的处理剂量为2.5U/106细胞，与HDFs共孵育时间为48h;③BoNTA处理组(5U48h):BoNTA的处理剂量为5U/106细胞，与HDFs共孵育时间为48h;④BoNTA处理组(7.5U48h):BoNTA的处理剂量为7.5U/106细胞，与HDFs共孵育时间为48h;⑤BoNTA处理组(5U24h):BoNTA的处理剂量为5U/106细胞，与HDFs共孵育时间为24h;⑥BoNTA处理组(5U72h):BoNTA的处理剂量为5U/106细胞，与HDFs共孵育时间为72h
　　(3)第三部分:①对照组;②BoNTA处理UVB-IPS组(2.5U48h): BoNTA的处理剂量为2.5U/106细胞，与UVB-IPS的HDFs共孵育时间为48h;③BoNTA处理UVB-IPS组(5U48h): BoNTA的处理剂量为5U/106细胞，与UVB-IPS的HDFs共孵育时间为48h;④BoNTA处理UVB-IPS组(7.5U48h): BoNTA的处理剂量为7.5U/106细胞，与UVB-IPS的HDFs共孵育时间为48h;⑤BoNTA处理UVB-IPS组(5U24h):BoNTA的处理剂量为2.5U/106细胞，与UVB-IPS的HDFs共孵育时间为24h;⑥BoNTA处理UVB-IPS组(5U72h): BoNTA的处理剂量为5U/106细胞，与UVB-IPS的HDFs共孵育时间为72h。
　　2.RNA芯片筛选差异表达的RNA(lncRNA和mRNA)及生物信息学分析
　　使用TRIzol提取各组HDFs的总RNAs，进行RNA芯片分析。以归一化强度的|log2(Ratio)|≥2为条件筛选UVB-IPS的HDFs，BoNTA(5U48h)处理的HDFs和BoNTA(48h5U)处理UVB-SIPS的HDFs中差异表达的lncRNA和mRNA，并对所得差异RNA的靶基因进行GO分析以及pathway富集分析。使用qRT-PCR(Quantitative real time PCR，实时定量PCR)法验证UVBvs对照组、BoNTA(5U48h) vs对照组、BoNTA处理UVB-IPSvs对照组按照设定原则筛选的lncRNA和mRNA。
　　3、qRT-PCR法进一步验证筛选出来的lncRNA和mRNA
　　利用qRT-PCR法对筛选出来的各造模组中均差异表达的RNA(FGFR3P，COL19A1)进行进一步验证:即检测在BoNTA(5U48h) vs对照组、BoNTA处理UVB-IPSvs对照组中FGFR3P和COL19A1表达水平随BoNTA剂量、时间不同发生的变化。
　　结果：
　　1.UVB诱导提前衰老HDFs中lncRNA的筛选及初步分析:(1)以亚毒性计量的UVB(10m J/cm2)多次（5次）照射HDFs后，β-半乳糖苷酶阳性率显著高于未照光组(P＜0.05)。(2)利用差异倍数Fold change值进行筛选，设定差异倍数(Fold change，FC)值≥2时与对照组相比较，UVB诱导光老化HDFs中检测出差异表达的lncRNA和mRNA数分别为3224和1630个:生物信息学分析提示，差异表达的lncRNA涉及多种生物学功能，部分生物学功能与光老化有关，如:细胞对UVB的反应、自噬、细胞凋亡等。(3)选择出来RNAs的qRT-PCR的结果与RNA芯片分析结果趋势一致，证明芯片分析结果的可靠性。
　　2.A型肉毒毒素处理后人真皮成纤维细胞长链非编码RNA表达谱的筛选及初步分析:(1)与对照组相比较，BoNTA以5U/106细胞的剂量孵育48h后，设定FC≥2时，HDFs中差异表达的lncRNA和mRNA数分别为2124和638个。(2)生物信息学分析提示，差异表达的lncRNA涉及多种生物学功能，部分生物学功能与皮肤老化有关，如:胶原蛋白的产生、细胞增殖等。(3)初步选择出来RNAs的qRT-PCR的结果与芯片分析结果趋势一致;筛选出来FGFR3P和COL19A1的qRT-PCR验证结果说明BoNTA对FGFR3P和COL19A1表达的调控有一定的时间及剂量相关性。
　　3.A型肉毒毒素处理对UVB-IPS的HDFs中lncRNA表达谱的影响:(1)与对照组相比较，BoNTA以5U/106细胞的剂量孵育48h后，设定FC≥2时，UVB-IPS的HDFs中差异表达的lncRNA和mRNA数分别为1651和1221个。(2)生物信息学分析提示，差异表达的lncRNA涉及多种生物学功能，部分生物学功能与皮肤老化有关，如:如有丝分裂细胞周期G1/S间转换、成纤维细胞增殖、胶原蛋白产生、细胞老化等。(3)初步选择出来RNAs的qRT-PCR的结果与芯片分析结果趋势一致;进一步的qRT-PCR验证结果表明BoNTA对FGFR3P和COL19A1表达的调控与处理时间和剂量相关。
　　结论：
　　UVB和BoNTA可以显著改变HDFs中lncRNAs和mRNAs的表达水平，BoNTA亦可通过作用于UVB-IPS的HDFs而引起lncRNAs表达的变化;这些与包括皮肤老化在内的多种生物学行为有关。

目录

声明

全文主要缩略语

全文技术流程图

摘要

第一部分 UVB诱导提前衰老HDFs中lncRNA的筛选及初步分析

研究背景

材料与方法

结果

讨论

第二部分 A型肉毒毒素处理后人真皮成纤维细胞长链非编码RNA表达谱的筛选及初步分析

研究背景

材料与方法

结果

讨论

第三部分 A型肉毒毒素处理对UVB诱导提前衰老后人真皮成纤维细胞长链非编码RNA表达谱的影响

研究背景

材料和方法

结果

讨论

全文小结

参考文献

综述 光老化的机制和保护措旌的研究

读研期间发表的论文

致谢