长链非编码 RNA AK156230对小鼠胚胎成纤维细胞衰老的影响及其作用机制

摘要

【目的】 1.利用lncRNA芯片技术在小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts，MEFs）中筛选和鉴定差异表达的衰老相关lncRNAs。 2.探讨衰老相关lncRNA AK156230影响MEFs细胞衰老的分子机制。 【方法】 1.利用lncRNA表达谱芯片检测年轻与衰老MEFs中lncRNAs的表达。根据lncRNAs表达水平、差异倍数等条件初步筛选lncRNAs。 2.利用qRT-PCR方法验证在芯片中差异表达的lncRNAs（差异倍数≥2.5），其中AK156230、AK135413和AK048098的差异表达具有统计学意义。 3.在MEFs中转染特异性反义寡核苷酸（LNA longRNA GapmeR）抑制lncRNAs的表达，分别利用SA-β-gal、BrdU、生长曲线、流式细胞周期、Western blot等实验观察AK156230对MEFs衰老、增殖、生长能力、细胞周期和衰老相关蛋白的影响。 4.通过Western blot、透射电镜等实验观察AK156230对MEFs细胞自噬能力的影响。 5.利用 mRNA芯片分析检测 AK156230干扰谱的 mRNA表达情况，qRT-PCR验证差异表达mRNA。 【结果】 1.年轻与衰老MEFs中差异表达的lncRNAs 芯片结果显示，衰老中上调的lncRNAs有192条，衰老中下调的lncRNAs有97条（差异倍数≥2.0，P<0.05）。 2.衰老相关长链非编码RNA的鉴定 qRT-PCR分析结果显示 AK135413和 AK156230在衰老中下调，而AK048098在衰老中上调，与lncRNA芯片结果一致。 3. AK156230对MEFs细胞衰老、增殖与细胞周期的影响 结果表明，LNA longRNA GapmeR能够显著抑制AK048098、AK135413和 AK156230的表达，干扰效率均达到80~90%。在年轻 MEFs细胞中下调AK156230的表达，可以显著促进 MEFs细胞衰老、降低细胞增殖能力并导致细胞生长活力下降、引起细胞周期 G2/M期阻滞；同时显著增加衰老相关蛋白p53、p21的表达，上调磷酸化p53水平，并降低CDK1的表达。 4. AK156230对MEFs细胞自噬能力的影响 下调AK156230引起LC3-II表达降低，LC3-II/LC3-I的比例显著下降，细胞中的自噬溶酶体数量减少。Rapamycin诱导的自噬可逆转 AK156230下调引起的衰老表型。 5.干扰AK156230的表达谱分析 AK156230干扰谱芯片分析得到细胞自噬相关基因表达下调，抗增殖相关基因表达上调。 【结论】 1.鉴定出衰老相关的lncRNA AK156230，其在衰老的MEFs细胞中低表达。 2.下调AK156230表达可引起MEFs衰老、细胞增殖和自噬能力下降、以及细胞周期阻滞。 3. Rapamycin诱导的自噬可逆转AK156230下调引起的细胞衰老变化。 4.干扰AK156230后，自噬和细胞周期相关基因的失调与其自噬抑制和抗增殖表型一致。

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1 前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的

1.3 研究内容

2 MEFs细胞衰老相关长链非编码RNA的筛选与鉴定

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4 讨论

3 AK156230对MEFs细胞衰老表型的影响

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4 讨论

4 Rapamycin诱导的自噬逆转AK156230下调引起的细胞衰老

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果

4.4 讨论

5 AK156230影响MEFs细胞衰老的潜在机制

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 结果

5.4 讨论

6 全文总结

参考文献

综述:长链非编码 RNA与表观遗传调控

致谢

附录一： 缩写词中英文对照

附录二：在读期间的科研情况