AFB1诱导的B--2A13恶性转化细胞中circRNA-miRNA-mRNA的筛选及其作用的初步研究

摘要

目的:筛选与AFB1诱导的P50 B-2A13细胞恶性转化相关的circRNAs、miRNAs、mRNAs，探索circRNA-miRNA-mRNA在AFB1诱导B-2A13细胞恶性转化中的靶向调控作用。
　　方法:首先用miRNA芯片、mRNA芯片和cricRNA芯片检测经AFB1诱导的P50 B-2A13恶性转化细胞以及同期对照细胞（P50 B-Vector细胞）中miRNAs、mRNAs和circRNAs表达谱，比较分析这两种细胞之间差异表达的miRNAs、mRNAs和circRNAs。以miRNA为中心，采用TargetScan软件分析了差异表达的miRNAs靶基因，将这些靶基因与差异表达mRNA相匹配，保留共有的且表达水平相反的miRNA-mRNA调控关系，根据miRNA与circRNA靶向关系，通过筛选出的miRNAs在circRNA-miRNA库中找到对应的差异表达的circRNA，初步构建circRNA-miRNA-mRNA调控关系。结合pathway分析和疾病富集分析筛选出与肺癌可能相关的mRNAs，通过RT-qPCR对关键mRNAs，miRNA及ckcRNA进行验证。采用western blot验证mRNA在蛋白水平的表达。最后用瞬时转染siRNA干扰方法抑制ID3和FGF5基因的表达，用平板克隆和划痕愈合实验检测它们对P50 B-2A13细胞的增殖与迁移的影响。
　　结果:(1)在P50 B-2A13细胞和P50 B-Vector细胞之间，miRNA芯片分析得到差异表达的miRNAs有60个，其中表达上调的有37个，表达下调的有23个，mRNA芯片分析得到差异表达的mRNAs有1014个，其中表达上调的有771个，表达下调的有243个，circRNA芯片分析得到差异表达的circRNAs有4313个，其中表达上调的有1496个，表达下调的有2812个。(2)对差异表达的miRNAs、mRNAs和circRNAs靶向关联分析得到GJA1、ID3和FGF5为候选功能靶基因，miR-23c等6个miRNAs为调控中心以及hsa_circ_0002842等85个circRNA为海绵作用的调控关系。(3) RT-qPCR验证表明，miRNAs和mRNAs的表达和芯片结果高度一致，ckcRNA的表达与芯片结果一致性达到80％。(4)在P50-B-2A13细胞中，敲减ID3可以明显抑制细胞的克隆形成能力，但抑制FGF5对细胞克隆形成能力影响不大;抑制ID3和FGF5对划痕愈合都能起到一定的抑制作用，在划痕24h之后，空白组(P50 B-2A13)、对照组(P50 B-2A13+Negativecontrol)、敲降ID3（P50 B-2A13+ID3-siRNA）和敲降FGF5(P50 B-2A13+FGF5-siRNA)划痕愈合度分别为53.9％、51.1％、38.8％和30.6％。
　　结论:(1)以差异表达的miRNA为中心的靶向关联分析，结合肿瘤相关的差异表达的mRNA，初步发现以GJA1、ID3和FGF5为功能基础，miR-23c等多个miRNAs为调控中心、hsa_circ_0002842等多个circRNA为海绵作用的调控关系可能与AFB1诱导的B-2A13细胞恶性转化相关。(2) ID3对恶性转化的P50 B-2A13细胞的克隆形成能力和划痕愈合能力有一定的影响;FGF5虽然对细胞克隆形成能力的影响不显著，但可影响细胞的划痕愈合能力。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

结果

一、与B-2A13细胞恶性转化相关的cirCRNA-miRNA-mRNA的筛选

二、候选cirCRNA-miRNA-mRNA与细胞恶性转化相关性的初步验证

讨论

结论

参考文献

文献综述 环状RNA及其在肿瘤研究中的应用

附录

攻读硕士学位期间研究成果

致谢