mfat-1基因对氯化钴诱导的成体神经干细胞缺氧性损伤保护作用的研究

摘要

研究背景:随着人们生活方式和饮食习惯的改变，缺血性脑卒中已经成为成年人致死致残以及神经功能损伤的主要原因之一。据统计缺血性脑卒中占脑卒中的比例已超过80％，然而现在临床仍然缺乏有效的治疗手段。成体神经干细胞替代性治疗方法在神经系统结构和功能恢复治疗方面将有广阔的应用前景。但是，成体神经干细胞替代疗法应用于缺血性脑卒中临床治疗的最大障碍是在缺血半暗带区缺血缺氧的微环境对成体神经干细胞活性和功能的损伤。所以，能否找到一种保护缺血半暗带区成体神经干细胞免受缺血缺氧性损伤的方法是成体神经干细胞替代疗法临床应用的关键。
　　目的:通过建立成体神经干细胞体外缺血缺氧性损伤模型，探讨mfat-1基因是否对氯化钴诱导的成体神经干细胞缺氧性损伤具有保护作用，同时进一步研究其内在机制，为成体神经干细胞替代疗法的临床应用打下基础。
　　方法:mfat-1转基因小鼠和其同窝阴性小鼠饲养至8-12周龄，基因型鉴定完成后，无菌环境下提取两组小鼠大脑Subventricularzone(SVZ)区神经干细胞，培养至第三代用于以下实验。细胞免疫组化鉴定神经干细胞标志蛋白Nestin，通过气相色谱技术分别测定mfat-1组及同窝阴性组鼠脑和神经干细胞n-3/n-6的比值。通过氯化钴诱导体外构建成体神经干细胞缺血缺氧模型;通过测定两组细胞的细胞活性，细胞凋亡率和细胞增殖率来研究mfat-1基因对成体神经干细胞体外缺氧性损伤的保护作用。为了进一步探究mfat-1基因的作用机制，我们分别测定了两组细胞活性氧水平以及谷胱甘肽表达水平，确定了mfat-1基因的保护机制是通过促进抗氧化应激损伤来完成的。我们选取了抗氧化应激的关键信号通路Nrf2/ARE信号通路，分别检测了Nrf2及下游基因HO-1、NQO-1、GCLC mRNA表达水平以及蛋白表达水平。
　　结果:mfat-1基因可以增强氯化钴诱导的缺氧性损伤中成体神经干细胞的细胞活性，与此同时抑制氯化钴介导的成体神经干细胞的凋亡。通过BrdU标记实验表明，在氯化钴诱导的体外缺氧损伤模型中，mfat-1组的细胞增殖率明显高于同窝阴性对照组。活性氧水平以及细胞谷胱甘肽表达水平检测结果显示mfat-1组细胞活性氧水平明显低于同窝阴性对照组，同时谷胱甘肽表达量明显高于同窝阴性对照组。实时定量PCR检测结果显示Nrf2及其下游基因的mRNA的表达量均高于同窝阴性对照组。Western blot检测结果显示Nrf2及其下游基因HO-1、NQO-1、GCLC的蛋白表达量均高于对照组。
　　结论:fat-1基因对氯化钴介导的成体神经干细胞缺氧性损伤具有保护作用，其潜在的机制可能是激活Nrf2/ARE信号通路，来上调抗氧化因子及二相解毒酶的表达。这为成体神经干细胞替代疗法的临床应用奠定了理论基础。

目录

声明

全文主要缩略词

摘要

前言

第一部分 成体神经干细胞体外分离、培养及鉴定

1．1 实验仪器

1．2 实验材料

1．3 实验试剂

1．4 试剂配制

2 实验方法与步骤

2．2 mfat-1小鼠和同窝阴性C57BL／6小鼠的基因型鉴定

2．3 原代成体神经干细胞的分离与培养

2．4 成体神经干细胞体外标记后免疫组织化学鉴定

2．5 成体神经干细胞体外诱导分化及分化表型鉴定

2．6 n-3／n-6多不饱和脂肪酸比例测定

2．7 数据分析

3 实验结果

4 实验小结

第二部分 mfat-1基因对体外培养的成体神经干细胞缺氧性损伤的保护作用的研究

1．1 实验仪器

1．2 实验材料

1．3 实验试剂

1．4 试剂配制

2 实验方法与步骤

2．1 氯化钴体外诱导成体神经干细胞缺氧性损伤

2．2 成体神经干细胞活性测定

2．3 成体神经干细胞凋亡率测定

2．4 成体神经干细胞增殖率测定

2．5 数据分析

3 实验结果

4 实验小结

第三部分 Nrf2／ARE信号通路与mfat-1基因成体神经干细胞保护作用相关性研究

1 实验仪器与材料

1．1 实验仪器

1．2 实验材料

1．3 实验试剂

1．4 试剂配制

2 实验方法与步骤

2．1 成体神经干细胞细胞内ROS水平检测

2．2 成体神经干细胞单位蛋白GSH含量检测

2．3 成体神经干细胞总RNA提取

2．4 实时定量PCR检测Nrf2／ARE信号通路下游基因表达水平

2．5 成体神经干细胞胞核蛋白与胞浆蛋白的提取

2．6 Western blot检测Nrf2／ARE信号通路下游基因蛋白表达水平

2．7 数据分析

3 实验结果

4 实验小结

讨论

参考文献

综述部分 Fat-1基因及其功能研究进展

攻读学位期间发表文章情况及科研工作情况

致谢