致耐受性纳米颗粒直接靶向清除和调节自身反应性T细胞治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的研究

摘要

背景：目前许多纳米材料已被报道用于治疗多发性硬化症（MS）或其疾病模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），但大多数纳米制剂是通过递送髓磷脂抗原、细胞毒素或细胞因子等来诱导耐受性抗原呈递细胞的形成，从而间接地诱导T细胞耐受。其主要的不足是在体内诱导APCs存在多种不确定性。因此，自体反应性T细胞的直接和靶向清除及调节更值得深入研究。 目的：本研究旨在制备负载多种调节性分子的致耐受性纳米颗粒（tolerogenic nanoparticles，tNPs），在MOG35-55肽诱导的EAE小鼠体内直接靶向调节MOG自身反应性CD4+和CD8+T细胞，从而达到改善和缓解EAE病情发展的目的。 方法：以可生物降解的聚乳酸-羟基乙酸聚合物（PLGA）为载体材料，经双乳化挥发法制备粒径为200nm左右的PLGA纳米颗粒（PLGA-NPs），在其内部包裹TGF-β1后通过化学修饰法使其表面功能化，继而在表面装载分别靶向识别MOG35-55特异性CD4+T细胞和MOG40-54特异性CD8+T细胞的pMHC多聚体以及两种负调节分子（anti-Fas-mAb、PD-L1-Fc）和抗吞噬分子（CD47-Fc），最终制备成装载5种免疫分子的多功能的致耐受性纳米颗粒（tNPs），并通过静脉输注到EAE小鼠体内，研究其治疗效果，在体内的时空分布及相关作用机制等。 结果：（1）成功制备了平均粒径为217nm的多功能致耐受性纳米颗粒tNPs，具有正确表型，且包裹在内部的TGF-β1能够持续释放；（2）四次尾静脉输注tNPs可以有效缓解和改善EAE小鼠的临床症状，减轻其脑脊髓局部炎性细胞浸润和脱髓鞘程度以及T细胞的浸润；（3）活体成像观察结果显示tNPs可经血流分布各主要脏器，滞留36h左右，并可突破血脑屏障，进入EAE鼠脑组织；免疫荧光染色证实tNPs在大脑皮层可与CD3+T细胞相结合；（4）脾脏免疫荧光染色显示tNPs主要分布于边缘区和红髓，并靶向结合CD4+和CD8+T细胞，同时较少被巨噬细胞及DC细胞吞噬；（5）tNPs治疗明显促进EAE鼠脾脏中T细胞的凋亡，抑制T细胞的同种增殖，降低MOG反应性Th1、Th17、Tc1以及Tc17细胞的频率，并促进调节性T细胞的增殖。同时，tNPs治疗还能上调脑脊髓组织匀浆和脾细胞培养上清中TGF-β1和IL-10等抑制性细胞因子的表达。 结论：装载5种免疫分子的tNPs可通过表面呈递和旁分泌方式对自身反应性T细胞进行直接地靶向调节，有效抑制EAE的发展。本研究为T细胞介导的自身免疫疾病提供了一种新的特异性主动免疫疗法。

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绪论

文献综述

第一节 致耐受性纳米颗粒的制备与验证

前言

1. 材料和试剂

1.1 主要试剂和材料

1.2 主要实验仪器

2. 方法

2.1 表面功能化PLGA纳米颗粒的制备及表征检测

2.2 致耐受性纳米颗粒（tNPs）的制备

2.3 致耐受性纳米颗粒（tNPs）的验证

3.结果

3.1 tNPs的设计

3.2 表面功能化PLGA-NPs的表征检测

3.3 tNPs的缓释效率和表型验证

4. 讨论

第二节 致耐受性纳米颗粒对EAE的疗效研究

前言

1. 材料和试剂

1.1 主要试剂

1.2 主要仪器

1.3 实验动物

1.4 常规试剂配方与造模试剂准备

1.5 抗原乳化

2. 方法

2.1 构建EAE小鼠模型及临床观察

2.2 tNPs制备及验证

2.3 tNPs治疗小鼠EAE模型

2.4 组织病理学检查

2.5流式检测EAE小鼠脑和脊髓组织中CD4+ 和CD8+ T细胞

2.6 统计学分析

3. 结果

3.1 EAE造模情况

3.2 tNPs治疗能明显缓解小鼠EAE病情

3.3 tNPs治疗能明显减轻中枢神经系统的病理变化

4. 讨论

第三节 致耐受性纳米颗粒治疗EAE的体内机制探讨

前言

1.材料和试剂

1.1 主要试剂和材料

1.2 主要仪器

1. 3实验动物

1.4常规试剂配方与造模试剂准备

2. 方法

2. 1 tNPs在EAE小鼠体内的示踪和组织分布

2. 2 tNPs在体内与免疫细胞的共定位观察

2.3 流式细胞术检测MOG特异性的Th1、Th17、Tc1、Tc17细胞

2.4调节性T细胞的检测

2.5 ELISA检测促炎性细胞因子与抑制性细胞因子

2.6 tNPs在体内诱导CD4+和CD8+ T细胞的凋亡

2.7 CFSE染色法检测T细胞增殖能力

2.8 统计学方法

3. 实验结果

3.1 tNPs在EAE小鼠体内的运行与组织分布

3.2 tNPs在EAE小鼠体内与CD4+和CD8+ T细胞的直接接触

3.3 tNPs治疗明显降低EAE鼠脾脏中Th1、Th17、Tc1和Tc17细胞的频率

3.4 tNPs治疗诱导EAE小鼠脾脏中调节性T细胞扩增

3.5 tNPs治疗诱导EAE小鼠脾细胞上清和脑脊髓匀浆中抑制性细胞因子表达

3.6 tNPs治疗诱导EAE小鼠T细胞凋亡并抑制抗原特异性T细胞增殖

4. 讨论

小结与展望

参考文献

致 谢

作者简介及发表的文章