延边黄牛D型魏氏梭菌病间接ELISA诊断方法的建立

摘要

魏氏梭菌是一种梭状芽孢属条件性致病菌，该病广泛分布于自然界，是肠道中的常在菌群之一。在一定条件下，可引起机体严重的疾病。延边地区是魏氏梭菌病的高发区，尤其对延边黄牛的危害极为严重。而针对该病的检测尚无一套完整的血清学技术，因此，本研究将提取的D型魏氏梭菌制成菌体抗原，并建立了检测该病的间接ELISA方法。 本实验对间接ELISA的反应条件进行了摸索，确定了最适工作条件。结果表明，美国Costar公司生产的酶标板的变异系数为4.5％，达到间接ELISA的要求；D型魏氏梭菌菌体裂解抗原最适包被浓度为50μg/ml，最适包被条件为37℃1h；被检血清的最适稀释度为1：100，酶标二抗的最适工作浓度为1：1 000，血清与酶标二抗的反应时间均为37℃1h；最适封闭时间为37℃1h；PBST稀释液中脱脂乳的浓度为3％；底物最适反应条件为室温25min：阴阳性临界值为0.032。经特异性试验和重复性试验，表明建立的间接ELISA方法是特异的，且重复性好；对采集于延边地区的100份牛血清样品进行间接ELISA检测，结果阳性率为11％。 本试验应用D型魏氏梭菌菌体裂解抗原为抗原，成功建立了一种检测延边黄牛血清中D型魏氏梭菌抗体的间接ELlSA诊断方法，为延边黄牛D型魏氏梭菌疾病免疫监测和血清学调查提供了一种快捷、敏感、特异的血清学诊断方法。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1病原体

2毒素

3流行病学

4临床症状

5病理变化

6魏氏梭菌对人类的危害

7诊断方法

8防治措施

9本课题研究的目的和意义

试验研究

1材料

1.1制备抗原所用试剂

1.2间接ELISA所用试剂

1.3主要仪器

1.4试验用抗原及血清

2方法

2.1 D型魏氏梭菌菌体裂解抗原制备

2.2间接ELISA方法的建立

2.3间接ELISA方法特异性和重复性试验

2.4间接ELISA方法与琼脂扩散方法的比较试验

2.5现地血清样品的检测

结果

1 D型魏氏梭菌菌体裂解抗原的制备

2间接ELISA方法的建立

2.1反应板均一性的测定

2.2抗原最适包被浓度及血清最适稀释度的确定

2.3抗原的最适包被温度及最适包被时间的确定

2.4血清最适作用时间的确定

2.5酶标二抗最适工作浓度及最适作用时间的确定

2.6 PBST稀释液中封闭液浓度的确定

2.7底物最适显色时间的确定

2.8间接ELISA方法阴阳性临界值的确定

3间接ELISA方法的特异性和重复性试验

3.1特异性试验

3.2板内重复性试验

3.3板间重复性试验

4间接ELISA方法与琼脂扩散方法的比较试验

5现地血清样品的检测

讨论

结论

参考文献

致谢

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