重组乙酰胆碱受体亚单位-BirA识别多肽序列基因的构建与表达

摘要

目的：构建重组乙酰胆碱受体α亚单位-BirA识别多肽序列基因（pcDNA3.1-AChRα-BirA）并对其进行真核基因表达。
　　方法：设计引物生物素蛋白连接酶（BirA）识别多肽序列基因。将载体 pcDNA3.1-AChRα经限制性核酸内切酶EcoRⅴ单酶切后，用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收并纯化，与BirA识别多肽序列基因连接。将连接产物转化至感受态细胞 E. coli DH5α并扩增，再用EcoRⅴ单酶切检查BirA识别多肽序列基因插入的正确性，并测序验证，然后将构建成功的载体在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表达。表达产物以绿色荧光标记，经激光扫描共聚焦显微镜验证。
　　结果：电泳检查发现了大小为63 bp的条带，并测序验证了插入的基因序列为BirA识别多肽序列基因。转染后，经激光扫描共聚焦显微镜可观察到CHO细胞膜上的绿色荧光。
　　结论：成功构建了AChRα-BirA识别多肽序列基因重组载体，并在CHO细胞中很好表达。本实验为下一步构建AChRα四聚体并作为抗原检测乙酰胆碱受体抗体奠定了基础。

目录

第一章 前言

第二章 实验材料

2.1 实验仪器

2.2 实验试剂

2.3菌种、载体和细胞

2.4培养基的制备

2.5溶液的配制

第三章 实验方法

3.1 E.coli DH5α菌种的复苏

3.2氯化钙法制备感受态细胞

3.3质粒pcDNA3.1-AChRα的细菌转化

3.4 引物设计与合成

3.5 构建pcDNA3.1-AChRα-BirA多肽识别序列基因载体

3.6 pcDNA3.1-AChRα-BirA多肽识别序列基因载体在CHO细胞的表达

第四章 结 果

4.1DNA纯化试剂盒提取质粒

4.2合成引物电泳检测

4.3重组载体的酶切鉴定

4.4核苷酸序列检测验证重组载体正确性

4.5 激光扫描共聚焦显微镜观察

第五章 讨 论

5.1 四聚体技术的选择

5.2 AChRα亚单位的选择

5.3载体及酶切位点的选择

5.4克隆

5.5 表达载体细胞的选择

结论

参考文献

致谢

综述:MHC-肽四聚体技术的应用