重组人NADH脱氢酶亚单位4基因及其表达载体构建方法

摘要

本发明公开一种重组人NADH脱氢酶亚单位4基因及其表达载体构建方法，其核苷酸序列SEQ ID NO：1所示，其大小为2889bp。腺相关病毒载体的构建步骤如下：先构建含有人NADH脱氢酶亚单位4基因重组腺相关病毒载体，然后重组腺相关病毒包被、转染、纯化、浓缩、鉴定。该方法能快速，简便地构建携带重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组腺相关病毒载体，并包装获得复杂缺陷腺相关病毒载体。该基因可以用于LHON的基因治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组人NADH脱氢酶亚单位4基因及其表达载体构建方法，属于基因工程技术领域。 

技术背景

Leber遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)是一种主要累及黄斑乳头束纤维，导致视神经退行性变的线粒体遗传性疾病。本病好发于青中年男性，临床表现为双眼同时或先后急性或亚急性无痛性视力减退，同时可伴有中心视野缺损及色觉障碍。 

LHON由线粒体位点突变引起，我国学者已初步确认中国95％以上的LHON患者分别与线粒体DNA11778、14484和3460的位点突变有关，其中111778位点突变最常见，占我国LHON的89.2％，且预后最差。线粒体DNA11778位点突变的发病机制是，线粒体DNA(mtDNA)第11778核苷酸发生突变引起的，即鸟嘌呤(G)→腺嘌呤(A)，此突变使呼吸链上NADH脱氢酶亚单位4中(ND4)基因编码的第340位氨基酸由精氨酸变为组氨酸。虽然它们均为碱性氨基酸，但这一位置的精氨酸是高度保守的。由于突变可能降低电子流动效率影响酶的活性从而减少视神经细胞ATP的产生，细胞逐渐凋亡，从而导致患者发生LHON。 

LHON目前尚无方法治疗，是世界公认的青少年致盲眼病之一，随着基因治疗的发展，LHON的基因治疗成为可能，其中的难点在于转染的基因进入细胞核，而LHON的突变位点在线粒体DNA，是线粒体中的ND4异常所致。 

国外的研究中也有人使用这一技术，但国外研究中设计的核酸序列都 加入了绿色荧光蛋白(GFP)，这样的核酸序列可以用于实验研究，无法使用到人的治疗中。 

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种重组人NADH脱氢酶亚单位4基因。 

本发明的第二个目的是提供一种重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组应用腺相关病毒载体的构建方法，该方法能快速，简便地构建携带重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组腺相关病毒载体，并包装获得复杂缺陷腺相关病毒载体。 

本发明的第三个目的是提供重组腺相关病毒rAAV2/2-ND4在兔子中的临床应用。 

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的： 

重组人NADH脱氢酶亚单位4基因，其核苷酸序列SEQ ID NO：1所示，其大小为2889bp。自1bp至1464bp区段为其开放阅读框，起始于密码子ATG，编码487个氨基酸，其中前面的84个核酸是COX10的一段序列，编码28个氨基酸的肽链，其功能是引导ND4蛋白进入到线粒体中，发挥其生理功能，后面的1380个核酸编码ND4的459个氨基酸加上3个终止密码子，这1380个核酸是在细胞核里编码ND4的459个氨基酸，与目前公开发表的在线粒体里面编码ND4的核酸序列不同；3’非编码区长为1425bp的COX103’UTR。 

重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组应用腺相关病毒载体的构建方法，其步骤包括： 

(一)、含有人NADH脱氢酶亚单位4基因重组腺相关病毒载体的构建 

将权利要求1所述重组人NADH脱氢酶亚单位4基因SEQ ID NO：1加Kpn I和Sal I两个酶切位点或者将以该新基因设计引物用PCR扩增的产物与pSNaV质粒载体，分别进行Kpn I和Sal I双酶切，回收酶切产物，T4DNA Ligase连接过夜，连接产物转化感受态细胞得到重组pSNaV/ rAAV2/2-ND4。 

(二)、rAAV2/2-ND4重组腺相关病毒包被 

1)、转染前一天，将293T细胞接种于225cm²细胞培养瓶中，接种密度3.0×107个/mL细胞，培养基为DMEM+10％牛血清，置37℃含5％CO₂的培养箱中培养过夜。 

2)、转染当天换液，用新鲜的含10％牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至80～90％时，弃去培养基，用PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒进行转染。具体步骤为： 

(a)每个转染瓶取pAdHelper、pAAV-r2c5、pSNaV-ND4质粒按要求比例与DMEM+PlasmidTrans II(VGTC)(转染试剂)在1.5mL无菌Ep管中混匀，编号为A试剂，室温静止10～15min； 

(b)将A试剂同30mL DMEM+10％牛血清混合均匀，编号为B试剂； 

(c)将B试剂均匀加入细胞培养瓶中，37℃含5％CO₂的培养箱中继续培养； 

(d)转染16h后，换完全培养基(DMEM+10％牛血清)。 

3)、转染48h后，收取细胞。 

4)、将收取细胞用PBS重悬，并反复冻融3次。 

(二)rAAV2/2-ND4病毒的纯化与浓缩 

采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三步来分离、浓缩和纯化rAAV2/2-ND4病毒。 

(三)rAAV2/2-ND4的目的基因的PCR鉴定 

取10uL重组rAAV2/2-ND4载体病毒样品，煮沸5min，冰浴，取1uL作为模板， 

所述特异性引物为： 

1F：5’-ATCTCCGCACACTCTCTCCTCA-3’； 

1R：5’-GAGGAA A ACCCGGTAATGATGTC-3’； 

(四)、rAAV2/2-ND4的滴度测定 

标记探针点杂交方法检测病毒液中rAAV2/2-ND4的物理滴度。 

本发明的具有如下优点和显著的进步：该核苷酸序列SEQ ID NO：1通过与腺病毒载体重组后转染视网膜细胞，进入其核染色体内，并在胞液中表达出正常的蛋白质-ND4蛋白，该蛋白N末端有信号肽，定向引导该蛋白进入线粒体，被蛋白酶水解后，成熟的ND4蛋白进入线粒体发挥作用。因此，通过构建rAAV2/2-ND4，制备玻璃体腔注射的药物，用于研究该基因在LHON的基因治疗中的作用。 

附图说明

图1为重组腺相关病毒中的ND4目的基因； 

图2为构建好的pSNaV/rAAV2/2-ND4载体图； 

图3为重组腺相关病毒中的浓缩检测图； 

图4为用PCR检测重组腺相关病毒中的ND4目的基因； 

图4中，M：Maker，1：目的片段，2：阳性对照，3：阴性对照； 

图5为用检测重组腺相关病毒中的ND4目的基因的测序图； 

图6为rAAV2/2-ND4的滴度测定结果； 

图7为实验组和对照组的眼底照相结果； 

图7中，A为rAAV-GFP组，B为rAAV-ND4组； 

图8为视网膜荧光照相的结果显示； 

图8中，A为rAAV-GFP组，B为rAAV-ND4组； 

图9为视网膜免疫荧光的结果显示； 

图9中，A为rAAV-GFP组，B为rAAV-ND4组； 

图10为Western blot检测ND4蛋白的表达图； 

图11为OCT检测示意图； 

图11中，A为rAAV-GFP组，B为rAAV-ND4组。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。 

实施例1 

一、试验材料 

表1 

二实验步骤 

本发明重组人的NADH脱氢酶亚单位4(ND4)的新基因序列是根据genbank数据库提供的ND4基因序列和cox10基因序列进行重新设计而成。本发明的基因序列分两部分设计而成(图1)。第一部分包括cox10的线粒体定位序列(mitochondroitin-targeting sequence MTS)和ND4的编码序列。其中，由于mtDNA与核基因组的遗传密码不完全同，本发明根据ND4蛋白的氨基酸序列修改了其基因序列，使修改后的新基因序列在胞液中翻译出的氨基酸序列与genbank数据库提供的ND4的基因序列在线粒体内翻译出的氨基酸序列完全相同。第二部分为cox10的3’非编码区(Untranslated Regions UTR)。ND4的新基因序列如下。该基因DNA全长2889bp，自1bp至1464bp区段为其开放阅读框，编码487个氨基酸，无5’非编码区，起始于密码子ATG，3’非编码区长1425bp(图1)。 

重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组应用腺相关病毒载体的构建方法，其步骤包括： 

(一)、含有人NADH脱氢酶亚单位4基因重组腺相关病毒载体的构建 

将权利要求1所述重组人NADH脱氢酶亚单位4基因SEQ ID NO：1加Kpn I和Sal I两个酶切位点或者将以该新基因设计引物用PCR扩增的产物与pSNaV质粒载体，分别进行Kpn I和Sal I双酶切，回收酶切产物，T4DNA Ligase连接过夜，连接产物转化感受态细胞得到重组pSNaV/rAAV2/2-ND4(图2)。 

(二)、rAAV2/2-ND4重组腺相关病毒包被 

1)、转染前一天，将293T细胞接种于225cm²细胞培养瓶中，接种密度3.0×107个/mL细胞，培养基为DMEM+10％牛血清，置37℃含5％CO₂的培养箱中培养过夜。 

2)、转染当天换液，用新鲜的含10％牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至80～90％时，弃去培养基，用PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒进行转染。具体步骤为： 

(a)每个转染瓶取pAdHelper、pAAV-r2c5、pSNaV-ND4质粒按要求比例与DMEM+PlasmidTrans II(VGTC)(转染试剂)在1.5mL无菌Ep管中混匀，编号为A试剂，室温静止10～15min； 

(b)将A试剂同30mL DMEM+10％牛血清混合均匀，编号为B试剂； 

(c)将B试剂均匀加入细胞培养瓶中，37℃含5％CO₂的培养箱中继续培养； 

(d)转染16h后，换DMEM+10％牛血清完全培养基； 

3)、转染48h后，收取细胞。 

4)、将收取细胞用PBS重悬，并反复冻融3次。 

(二)rAAV2/2-ND4病毒的纯化与浓缩 

采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三步来分离、浓缩和纯化 rAAV2/2-ND4病毒。总回收率＝终产物的病毒颗粒数/起始物的病毒颗粒数。灌制SDS-PAGE分离胶和积层胶，分离胶浓度为10％。分别按每个加样孔加样15μg。电泳完毕后用考马斯亮蓝染色，用相应的脱色液脱色直到显出低背景的、清晰的条带(图3)。 

(三)rAAV2/2-ND4的目的基因的PCR鉴定 

1)取10uL重组rAAV2/2-ND4载体病毒样品，煮沸5min，冰浴，取1uL作为模板， 

所述特异性引物为： 

1F：5’-ATCTCCGCACACTCTCTCCTCA-3’ 

1R：5’-GAGGAAAACCCGGTAATGATGTC-3’ 

反应体系 

PCR扩增程序： 

2)PCR产物回收 

对PCR产物电泳检测(图4)，得到一个大小约2800bp左右的目的条带。对目的条带回收，具体的回收步骤依照TIANGEN公司的凝胶回收试剂盒说明书。 

3)扩增产物的连接与转化反应 

连接反应使用TaKaRa公司的pMD18-T Vector 

混匀后瞬时离心，将管壁上的液滴收集到管底，16℃连接12小时。 

连接产物转化： 

A取连接产物5.0μL加入100μL DH-5α中，冰浴30min。 

B 42℃热激30秒，立即放回冰浴中。2min后加入800μL LB液体培养基(无抗生素)， 

C 37℃，200rpm，摇动培养1h。 

D取200μL转化菌均匀涂布于含50ug/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养16h，观察平板上细菌的生长情况。 

4)重组子的筛选及鉴定 

蓝白斑筛选：取37℃培养后的LB平板，出现蓝斑和白斑，其中白色为重组克隆。挑取白色的菌落加入到含有Amp 100mg/L的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养8h。培养好后取菌液，提取质粒，质粒提取步骤参照Biomiga说明书，使用EcoR I和HindIII酶切鉴定。 

5)菌液保存及cDNA片段测序 

吸取1mL经过鉴定的菌液与灭菌后的的甘油1∶3比例混匀，于-72℃保存，菌液测序在华大基因完成(图5)，将测序得到的序列与重组人NADH脱氢酶亚单位4基因比对分析，成功得到序列正确的重组腺相关病毒质粒 pSNaV/rAAV2/2-ND4。 

(四)、rAAV2/2-ND4的滴度测定 

用地高辛标记的H1探针点杂交方法检测病毒液中rAAV2/2-ND4的物理滴度。将质粒pSNAV-ND4准确定量，用稀释缓冲液以一系列稀释度稀释后点到尼龙膜上；待测的病毒液rAAV2/2-ND4样品用DNase I和RNase于37℃消化1h。提取rAAV2/2-ND4病毒基因组，沸水浴5min变性之后置于冰浴中。用试剂盒提供的稀释缓冲液以一定比列做系列稀释后点膜。预杂交、杂交、洗膜、显色按Boehringer Mannheim公司试剂盒说明书进行。通过计算pSNAV-ND4的拷贝数、再乘以与其杂交信号强度一致的病毒液样品的稀释倍数而得出rAAV2/2-ND4的物理滴度(图6)，其基因组滴度为4.4×10¹¹vg/mL。 

实施例2：rAAV2/2-ND4重组腺相关病毒对Leber遗传性视神经病变的效果实验 

1.兔眼玻璃体腔注射 

取24只兔子分为两组，分为实验组和对照组分别用0.1％的rAAV-ND4和0.1％rAAV-GFP在距角膜缘外3mm处穿刺睫状体平坦部进入玻璃体腔内，进行玻璃体腔注射。 

2、裂隙灯、眼压、眼底照相检查 

两组兔子分别于术后1、3、7、30天进行裂隙灯，眼压的检查。所有兔子均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后一个月的眼底照相显示，所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害(图7)。表明正规标准的玻璃体腔注射不会发生明显的炎症反应或其他并发症。 

3、视网膜的荧光照相 

玻璃体腔注射30天后，GFP组视网膜的荧光照相显示，GFP成功地被表达在视网膜上(图8)，表明以rAAV为载体，携带GFP转染兔眼玻璃 体内，证明rAAV-ND4重组基因可以在视网膜上表达。 

4、ND4的免疫荧光检测 

玻璃体腔注射30天后，视网膜抗ND4的免疫荧光结果显示，实验组和对照组的荧光强度分别为82.7±6.8和20.4±3.6。表明实验组视网膜上ND4的表达明显比对照组提高(P＝0.004；图9) 

5、OCT 

结果显示实验组和对照组的视网膜神经纤维层厚度分别为67.2±7.5μM和65.2±10.3μM，无明显差别(P＝0.68，图10)，VEP结果显示实验组和对照组P100波的潜伏期分别为58.6±7.5ms和55.3±6.2ms，无明显差别(P＝0.59)。 

6、Western blot检测ND4蛋白的表达 

蛋白质印迹实验组和对照组分别为0.25±0.05和0.12±0.01，表明实验组视网膜上ND4的表达明显比对照组提高(P＝0.001；图11)。 

7、real-time PCR检测ND4的表达 

首先用NCBI的保守结构域分析软件分析ND4的保守结构，确保所设计引物的扩增片段位于非保守区；然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用primer premier 5设计引物： 

兔-actin-S：CGAGATCGTGCGGGACAT 

兔-actin-A：CAGGAAGGAGGGCTGGAAC 

H-ND4-S：ctgcctacgacaaacagac 

H-ND4-A：agtgcgttcgtagtttgag 

7.1提取RNA、反转录 

利用TRIZOL试剂盒提取兔子的总RNA并反转录合成cDNA模板。 

7.2荧光定量PCR的反应体系和反应程序 

在Real-time PCR Detection System仪器上进行荧光定量PCR。在0.2mL的PCR反应管中加入SYBR Green mix12.5μL、ddH2O 8μL、5一对引物各 1μL，cDNA样品2.5μL，总体系25μL。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因兔-actin，各个基因的扩增都做三个重复。实际加样时，为减小误差，各PCR反应管中共有的试剂可加在一起然后分装。加样完毕，进行荧光定量PCR。 

按照95℃预变性1s，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸45s，共40个循环的反应程序进行扩增，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做94℃～55℃的融解曲线分析。 

采用2-ΔΔCT相对定量方法(Livak et al.2001)研究基因表达量的差异，该方法无需制作标准曲线，以看家基因兔-actin为内参基因，仪器自带的分析软件即可自动生成表达数值，实验组和对照组分别为0.74±0.10和0.37±0.03，表明实验组视网膜上ND4的表达明显比对照组提高(P＝0.002)。 

随着leber遗传性黑朦基因治疗的成功，LHON很有可能成为下一个能够进行基因治疗的疾病。因为人眼与兔眼的解剖和体积相似，我们以兔子眼睛为模型进行rAAV-ND4的玻璃体腔注射。本实验研究注射剂量，安全水平，术后并发症，为未来的临床试验提供重要的参考。 

所有兔子的裂隙灯，眼压的检查，均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后一个月的眼底照相显示，所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害。表明本实验是安全的 

免疫荧光、实时定量PCR和Western blot的结果证明ND4能被稳定地表达在兔子的视网膜上。ND4的荧光染色结果在视网膜神经节细胞中，表明rAAV-ND4能到达病人眼中病变的区域。眼底照相、OCT和VEP的结果显示单次玻璃体腔注射1.5×10¹⁰rAAV2-ND4是安全的。没有视网膜毒性，能被应用在未来的临床试验。因为LHON的病变主要发生在视盘周围的的视网膜神经节细胞，rAAV-GFP组的视网膜切片显示转导能被稳定地表达在视盘周围的视网膜上。