中药“连黄”对大肠埃希菌耐药基因AcrA影响的初步研究

摘要

中药“连黄”（精提，粗提）是本实验室以多味中药按照不同的配比方法，经过了大量的动物实验而筛选出来的科学组方。本研究采用聚合酶链式反应（PCR）及实时荧光定量 PCR法，通过耐药基因失活试验，检测中药“连黄”（精提，粗提）对大肠埃希菌的耐药基因AcrA的影响，通过对中药“连黄”（精提，粗提）作用前后的各耐药菌株耐药基因AcrA的mRNA表达水平进行定量检测并比较分析，研究中药“连黄”（精提，粗提）对大肠埃希菌耐药基因AcrA的mRNA表达水平的影响，初步探讨中药“连黄”降低多重耐药大肠埃希菌耐药性的作用机制。
　　由琼脂平板点种法结果可知，中药“连黄”（精提，粗提）对耐药大肠埃希菌 DL1的抑制率与敏感菌 K88比较差异不显著（P>0.05），对 NUT的抑制率与 K88比较差异显著（p<0.05）。并且精提制剂与粗提制剂比较差异极显著(p<0.01)。PCR法扩增的DL1的AcrA基因与ECU00734的AcrA基因同源性达100％；其相应的氨基酸序列同源性达100%；表明实验室成功扩增出大肠埃希菌耐药基因AcrA；NUT与ECU00734的AcrA基因同源性达99%。NUT与 ECU00734的同源性达98%。中药“连黄”（精提，粗提）作用前后大肠埃希菌的耐药基因 AcrA突变位点较集中，在608-693碱基区内发生较大改变，其对应的氨基酸序列也发生改变，且出现了氨基酸缺失。经实时荧光定量 PCR法定量检测的菌株 DL1、NUT的AcrA mRNA的表达量与相应的中药“连黄”（精提，粗提）作用前菌株比较均发生了不同程度的降低。并且精提制剂比粗提制剂对AcrA mRNA的表达量影响更大，mRNA的表达量降低程度更明显。
　　中药“连黄”（精提，粗提）在亚抑菌浓度下可有效的降低大肠埃希菌的四环素类，氯霉素类和喹诺酮类药物的耐药性；其降低多重耐药大肠埃希菌耐药性的作用机制是由于改变了其耐药基因AcrA的部分碱基，使AcrA基因 mRNA的表达量发生改变，中药“连黄”（精提，粗提）在亚抑菌浓度下对大肠埃希菌耐药基因AcrA的表达过程有一定的影响。

目录

声明

前言

1 细菌耐药性的研究现状

2与细菌多重耐药性相关的主动转运系统的分子生物学机制

3 大肠埃希菌多重耐药性研究进展

4大肠杆菌的多药外排泵AcrAB -TolC系统的研究动态

5 耐药性抑制剂的研究概况

6 中药消除细菌耐药性的研究现状

7 本课题的研究目的及意义

材料与方法

1 材 料

2 方 法

结果

1 细菌的鉴定

2 诱导耐药大肠埃希菌DL1的耐药性稳定性试验结果

3 中药“连黄”（精提，粗提）对大肠埃希菌的MIC测定结果

4 耐药性抑制试验结果

5 中药“连黄”（精提，粗提）作用前后模板DNA含量测定结果

6中药“连黄”（精提，粗提）作用前后AcrA基因PCR扩增产物的电泳分析

7 最适退火温度筛选试验结果

8 特异性试验结果

9目的片段的测序分析

10 阳性标准品的制备

11 待测靶序列的制备

12 标准曲线

13 实时荧光定量PCR结果

讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介

附 录（攻读学位期间发表论文目录）