中药“连黄”对沙门氏菌耐药基因aph(3')-Ⅱa影响的初步研究

摘要

本试验应用体外培养试验来初步研究中药“连黄”对耐药沙门氏菌的氨基糖苷类药物耐药性抑制作用。本研究采用聚合酶链式反应（PCR），通过耐药基因失活试验，检测中药“连黄”对沙门氏菌的耐药基因aph(3ˊ)-Ⅱa的影响，初步探讨中药复方“连黄”降低沙门氏菌对氨基糖苷类药物耐药性的作用机制。
　　本研究采用竞争性 RT-PCR法，对中药复方“连黄”作用前后的各耐药菌株耐药基因aph(3ˊ)-Ⅱa的mRNA表达水平进行定量检测并比较分析，研究中药“连黄”对沙门氏菌耐药基因aph(3ˊ)-Ⅱa的mRNA表达水平的影响，从而深入探讨中药复方“连黄”降低沙门氏菌对氨基糖苷类药物的耐药性的作用机理。本试验采用小鼠毒性试验及体内和体外试验来初步研究耐药性消除对细菌生物学特征的影响,进而研究中药“连黄”消除沙门氏菌耐药性对其生物学特征的影响。
　　结果：由琼脂平板点种法结果可知，中药“连黄”对沙门氏菌04D917、D01的耐药性抑制率与敏感沙门氏菌S1比较差异不显著，对沙门氏菌R01、R02的耐药性抑制率与敏感沙门氏菌 S1比较差异显著。由药敏纸片法结果可知，经中药“连黄”作用后耐药沙门氏菌04D917、D01对各抗生素的抑菌环大小与敏感菌S1比较差异不显著，R01对庆大霉素和卡那霉素的抑菌环大小与S1比较差异显著；且R01对阿米卡星的抑菌环大小与S1比较差异极显著，R02对阿米卡星的抑菌环大小与S1比较差异显著。PCR法扩增的耐药沙门氏菌D01的aph(3ˊ)-Ⅱa基因与Genbank中登录号为AJ601386的基因同源性达到100％；表明实验室成功扩增出沙门氏菌耐药基因 aph(3ˊ)-Ⅱa；04D917的aph(3ˊ)-Ⅱa基因与AJ601386的aph(3ˊ)-Ⅱa基因同源性达到99%；R01的aph(3ˊ)-Ⅱa基因与AJ601386的aph(3ˊ)-Ⅱa基因同源性达到98%。中药“连黄”作用前后沙门氏菌的耐药基因aph(3ˊ)-Ⅱa集中在319-340碱基区内发生较大改变，其对应的氨基酸序列也发生改变，且出现了氨基酸缺失。经竞争性RT-PCR法定量检测的菌株D01(后)、04D917(后)、R01(后)和R02(后)的aph(3ˊ)-Ⅱa mRNA的表达量与相应的中药“连黄”作用前菌株比较均发生了不同程度的降低。通过小鼠毒性试验及体内和体外试验结果可知，中药“连黄”消除耐药性后沙门氏菌对小鼠的毒力降低。在肝脏和脾脏中的存活数量及增长速度也显著降低。菌株D01(后)较D01的体外生长速度快，且比D01提前进入对数生长期，并持续较长的时间。
　　结论：中药“连黄”在亚抑菌浓度下可有效的降低沙门氏菌的氨基糖苷类药物的耐药性；其降低沙门氏菌对氨基糖苷类药物耐药性的作用机制是由于改变了其耐药基因aph(3ˊ)-Ⅱa的部分碱基，从而使耐药基因失活。
　　中药“连黄”在亚抑菌浓度下对沙门氏菌耐药基因aph(3ˊ)-Ⅱa的表达过程有一定的影响，并使耐药沙门氏菌的毒力降低，同时使体内存活与扩散的能力显著降低。

目录

声明

前言

1 细菌耐药性的发展现状

2 沙门氏菌的耐药性概况

3 细菌耐药性机制

4 沙门氏菌的耐药机制

5 沙门氏菌耐药基因aph的研究现状

6 耐药性抑制剂的研究

7 本课题的研究目的及意义

材料与方法

1 材 料

2 方 法

结果

1 细菌的鉴定

2 卡那霉素（Kan）对沙门氏菌的最小抑菌浓度（MIC）测定结果

3 中药复方“连黄”对沙门氏菌的MIC测定结果

4 耐药菌株诱导结果

5 诱导耐药沙门氏菌D01的耐药性稳定性试验结果

6 耐药性抑制试验结果

7 “连黄”作用前后模板DNA含量测定结果

8 “连黄”作用前后aph(3ˊ)-Ⅱa基因PCR扩增产物的电泳分析

9 最适退火温度筛选试验结果

10 特异性试验结果

11 目的片段的测序分析

12 中药复方“连黄”作用前后耐药基因aph(3ˊ)-Ⅱa序列对比分析

13 竞争性RT-PCR标准曲线的制备结果

14 中药复方“连黄”作用前后aph(3ˊ)-Ⅱa mRNA表达水平定量结果

15 耐药性消除对细菌生物学特性的影响结果

讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介

附 录（攻读学位期间发表论文目录）