结直肠癌中MicroRNA差异表达及miR139-5p相关Notch1基因检测的临床意义

摘要

目的：探讨microRNA差异表达和miR-139-5p相关Notch1基因在结直肠癌中表达的临床意义。
　　材料和方法：本实验选择14例诊断为结直肠癌的新鲜组织标本，其中包括2例高分化癌、10例中分化癌和2例低分化癌。应用这些标本提取总RNA并转化为cDNA。将得到的cDNA与含有3441种已知miRNA的芯片进行杂交检测，随后应用实时定量PCR方法对差异表达的miRNAs进行验证。同时，通过生物信息学的方法对差异表达的miRNAs进行靶向预测。在本实验中，我们选择了在结直肠癌中明显低表达的miR139-5p及其靶向的Notch1基因作为深入研究的对象，并应用免疫组化 EnVision法检测 Notch1蛋白在结直肠癌及癌旁正常组织中的表达水平，分析其蛋白检测结果在结直肠癌中的临床病理学意义。
　　结果：MicroRNA芯片检测结果表明，194种 miRNAs的表达显著增加而38种miRNAs的表达显著降低。表达显著增加的miRNAs主要有hsa-miR-31、hsa-miR-105和hsa-miR-196b等；显著降低的主要有hsa-miR-139-5p和hsa-miR-215等。通过生物信息学的方法对hsa-miR-139-5p的靶基因进行预测，通过TARGET SCAN靶基因预测网站检索和比对发现：与 hsa-miR-139-5p密切相关的基因有 NOTCH1、TMF1、USP6NL等。本实验中我们选择了 NOTCH1蛋白作为进一步实验的对象。免疫组化结果发现：miR-139-5p相关蛋白Notch1定位在细胞浆，在结直肠癌和正常结直肠组织中的阳性率分别为57.3％（43/75）和71.1%（27/38）。Notch1在有、无淋巴结转移的结直肠癌中的强阳性率分别为21.6%（8/37）和55.3%（21/38）（P<0.05）。Notch1蛋白在早期和晚期结直肠癌中的强阳性率分别为57.9%（22/38）和21.6%（15/56）(P<0.05)；同时，它在生存率大于5年的结肠癌病例中的强阳性率（59.4%，19/32）明显高于生存率小于5年的病例（23.3%，10/43）。但Notch1在高、中、低分化结直肠癌中的表达无统计学差异(P<0.05)，其强阳性率分别为36.0%(9/25)，44.4%(12/27)和34.8%(8/23)。
　　结论：与正常组织相比，在结直肠癌中存在明显的差异miRNAs表达谱。因此，MicroRNAs差异表达的检测将为结直肠癌的临床筛查及早期诊断提供理论参考指标。另外，在结直肠癌中显著降低表达的miR-139-5p相关蛋白Notch1可能成为评价结直肠癌临床预后的重要指标。

目录

声明

Sheet for Abbreviation

1 Introduction

2 Materials and Methods

2.1 Materials

2.1.1 Ethics Statement and Sample Selection

2.1.2 Grading of CRC

2.1.3 Primary antibodies and reagents

2.2 Methods

2.2.1 RNA Extraction

2.2.2 miRNA microarray and analysis

2.2.3 Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction

2.2.4 Bioinformatics analysis of miRNA targets

2.2.5 Immunohistochemistry in tissue microarray and paraffin-embedded tissues

2.3 Statistical analysis

3 Results

3.1 The differentially expression of miRNA in colon cancer by microarray

3.2 Real-Time RT-PCR validation

3.3 The target genes of hsa-miR-139-5p

3.4 Notch1 protein expression in CRC and normal tissue

3.5 Relationship between Notch1 protein overexpression and clinicopathological features of CRC

4 Discussion

5 Conclusions

参考文献

【综述】:MicroRNA的生物学特性及其与结直肠癌相关研究的进展

致谢

附录