抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备及胶体金诊断试纸条的研制

摘要

鹅细小病毒病是由鹅细小病毒引起的雏鹅和雏番鸭的一种高度接触性和败血性传染病，主要侵害4-20日龄的雏鹅。该病传播速度快，发病率和死亡率高。死亡率可高达100％，严重危害养鹅业的发展。鹅细小病毒是细小病毒科、细小病毒属成员，核甘酸序列含有两个开放阅读框架（ORF），右侧的ORF(RORF)编码VPl、VP2、VP3三种结构蛋白(VP)。VP3是该病毒的主要衣壳蛋白和重要保护性抗原，且能诱导机体产生具有中和作用的抗体。目前确诊该病通常借助于琼脂扩散试验，PCR试验等实验室诊断。但上述试验方法操作较复杂，费时，因此快速，简便，特异的试验方法更适合鹅细小病毒病的临床诊断，更有利于该病的现地诊断。 胶体金免疫层析技术以操作简单、敏感特异、不需要特殊设备，结果判断直观等为优点，被广泛应用于病毒、微生物、毒素和药物残留等方面的检测。 本试验应用鹅细小病毒VP3基因原核表达蛋白对BALB/c小鼠进行免疫，采用杂交瘤技术制备单克隆抗体，经多次亚克隆后获得了一株能稳定分泌抗GPV-VP3基因单克隆抗体的杂交瘤细胞系（4E5），经鉴定，其亚型为IgG1，轻链为κ链。经western blotting分析该单克隆抗体可特异性识别GPV及其VP3基因原核表达蛋白。 采用辛酸-硫酸铵法纯化该单克隆抗体。用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，用胶体金颗粒标记单克隆抗体制备金标探针，分别用兔抗GPV阳性血清和羊抗鼠IgG喷涂制作NC膜上的检测线和质控线，制备胶体金诊断试纸条，并优化试纸条的制备条件，结果表明，单克隆抗体与胶体金结合的最佳pH值为8.2，胶体金与单克隆抗体最佳结合浓度是25μg/mL。此条件下制备的胶体金检测试纸条对鹅细小病毒的检测效果最好。 本试验制备了抗 GPV-VP3基因单克隆抗体，并用该单克隆抗体制备了鹅细小病毒病胶体金诊断试纸条，为鹅细小病毒病的临床检测及基层兽医工作人员在现地进大批量检测提供便利，为疫病的早发现、早诊断、早治疗奠定基础。

目录

声明

前言

1.鹅细小病毒病的研究概述

2.单克隆抗体的研究进展及应用

3.胶体金快速诊断技术的研究进展及应用

材料与方法

1.材料

2.方法

结果

1.单克隆抗体的制备结果

2 胶体金试纸条制备结果

讨论

1.抗原

2.细胞融合及筛选

3.单克隆抗体的纯化

4.胶体金的制备

5.胶体金诊断试纸条的初步应用

结论

参考文献

致谢

作者简介

附录