磷酸二酯酶3对CNP抑制大鼠胃窦平滑肌自发性收缩运动的影响

摘要

环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）是构成细胞内“第二信使”的两个重要成员。腺苷酸环化酶（adenylyl cyclase，AC）和鸟苷酸环化酶（guanylyl cyclase，GC），可促进细胞内cAMP和cGMP的生成，而细胞内cAMP和cGMP的浓度则又取决于降解cAMP和cGMP的磷酸二酯酶超家族酶系（Phosphodiesterases，PDEs）的活性。PDEs蛋白家族可通过催化cGMP和cAMP水解而调节cAMP和cGMP水平，进而使蛋白磷酸化发生改变而干预信号转导过程，而PDEs自身也受cGMP和cAMP的调节。在胃肠道组织中发现至少五种磷酸二酯酶亚类型，他们是：(1)Ca2+/CaM刺激性PDE(PDE1)；(2)cGMP-激活性PDE(PDE2)；(3)cGMP-抑制性PDE(PDE3)；(4)cAMP-特异性PDE(PDE4)；(5)cGMP-特异性PDE(PDE5)等。C-型钠尿肽（C-type natriuretic peptide，CNP）通过B型钠尿肽受体(B-type natriuretic peptide receptor，NPR-B)生成cGMP。存在于胃肠道中的CNP通过CNP-NPR-B/pGC-cGMP信号转导途径抑制性调节胃平滑肌的自发性活动。因此，推测NPs有可能通过调节细胞内cGMP浓度的途径影响PDEs的活性，进而调节细胞内cAMP浓度，最终对胃平滑肌自发性收缩运动起调节作用。基于以上的前提，本实验采用离体肌条实验、酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)，利用不同工具药（Forskolin；H-89；CNP；IBMX；EHNA；Milrinone）对离体肌条收缩振幅和基线的影响，观察灌流液中各检测指标（cGMP和cAMP）的不同含量变化，探讨cAMP在大鼠胃窦行行平滑肌的自发性收缩活动中的作用，并进一步研究PDE是否参与CNP对胃窦行形平滑肌自发性收缩运动的抑制效应以及相关的传导途径。
　　实验结果如下：
　　1.不同浓度（10-8mol/L，3×10-8mol/L，10-7mol/L）的Forskolin，明显缩小肌条收缩振幅，明显下移收缩运动基线（n=6，*P<0.05，**P<0.01vsControl；＃P<0.05，＃＃P<0.01 vs10-8mol/L；&P<0.05 vs3×10-8mol/L），具有剂量依赖关系；ELISA法测得，cAMP量明显增加（n=8，*P<0.05，**P<0.01 vs Control；＃P<0.05，＃＃P<0.01 vs10-8mol/L；&P<0.05 vs3×10-8mol/L），具有剂量依赖关系，且胃窦环行肌条收缩振幅和灌流液中生成的cAMP量呈显著负相关（r=-0.7，P<0.01）；Forskolin对大鼠胃窦环行平滑肌自发性收缩活动抑制作用可被PKA抑制剂H-89所阻断（n=6，*P<0.01）。
　　2.
　　（1）加入CNP前收缩振幅/肌条重量与加入CNP后收缩振幅/肌条重量比较，CNP明显抑制大鼠胃窦环行平滑肌的收缩，具有显著性差异（n=8，*P<0.01）。ELISA法测得，加入CNP处理后，cGMP量明显增多（n=8，*P<0.01）；cAMP量明显增加（n=8，**P<0.01）。提示，CNP很可能通过生成cGMP来调节PDEs，进而影响到cAMP水平。
　　（2）在PDE非选择性抑制剂IBMX存在的基础上加入CNP后与只加入CNP时比较，收缩振幅抑制率明显降低，具有显著性差异（n=8，*P<0.01）。ELISA法测定，在IBMX存在下加入CNP后与只加入IBMX时比较，cGMP的含量明显增多（n=8，＃P<0.01），但是不能明显改变cAMP生成量（n=8，P>0.05）。表明IBMX抑制胃窦环行平滑肌的收缩运动，同时一部分阻断CNP对胃窦环行平滑肌收缩运动的抑制效应，提示PDEs有可能参与CNP对胃窦环行平滑肌收缩运动的抑制效应。
　　（3）在PDE2抑制剂EHNA存在的基础上加入CNP后与只加入CNP时比较，收缩振幅抑制率无明显变化（n=8，P>0.05）。ELISA法测定，在ENHA存在下加入CNP后与只加入ENHA时比较，cGMP的含量明显增加（n=8，＃P<0.05），cAMP的含量明显增加（n=8，＃P<0.05）。表明ENHA抑制胃窦环行平滑肌的收缩运动，而ENHA不能阻断CNP对胃窦环行平滑肌收缩运动的抑制效应，提示PDE2不参与CNP对胃窦环行平滑肌自发性收缩运动的抑制效应。
　　（4）在PDE3抑制剂Milrinone存在的基础上加入CNP后与只加入CNP时比较，收缩振幅抑制率明显降低，具有显著性差异（n=8，*P<0.01）。ELISA法测定，在Milrinone存在下加入CNP后与只加入Milrinone比较，cGMP的含量明显增多（n=8，＃P<0.05）；cAMP的含量无明显改变（n=8，P>0.05）。表明Milrinone可部分阻断CNP对胃窦环行平滑肌自发性收缩运动的抑制作用。提示PDE3参与CNP对胃窦环行平滑肌自发性收缩运动的抑制效应。
　　以上结果提示：
　　1.在大鼠胃窦环行平滑肌细胞，CNP通过GC-cGMP通路抑制PDE3，从而增加细胞内cAMP水平；
　　2.CNP通过GC-cGMP-PDE3信号转导通路调控cAMP的含量，并与cGMP共同参与抑制大鼠胃窦环行平滑肌的自发性收缩运动。

目录

声明

引言

第一章 材料与方法

1.2 实验方法及观察项目

1.2.3测定胃平滑肌肌条灌流液内cAMP和cGMP样本的处理

1.3统计学处理

第二章 结果

2.1.3 PKA抑制剂H-89对Forskolin抑制大鼠胃窦环行平滑肌的自发性收缩活动的影响

2.2 CNP对胃窦环形平滑肌肌条收缩运动及胃窦平滑肌肌组织cGMP和cAMP含量的影响

2.3 IBMX对CNP诱导大鼠胃平滑肌肌条收缩运动及胃平滑肌肌组织cGMP和cAMP含量的影响

2.4 EHNA对CNP诱导大鼠胃窦平滑肌肌条收缩运动及胃平滑肌肌组织cGMP和cAMP含量的影响

2.5 Milrinone对CNP诱导大鼠胃窦平滑肌肌条收缩运动及胃平滑肌肌组织cGMP和cAMP含量的影响

第三章 讨论

3.2 PDE亚类型在CNP抑制大鼠胃窦平滑肌自发性收缩运动中的作用

第四章 结论

文献综述:磷酸二酯酶3的研究进展

致谢

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