NQO1及其抑制剂在胃癌预后评估及靶向治疗中的作用研究

摘要

研究背景：胃癌隶属消化道恶性肿瘤范畴，起源于胃黏膜上皮，其发病率在消化道恶性肿瘤中位居首位。NQO1蛋白又称醌氧化还原酶，不仅是一种黄色素酶，也是一种II相解毒酶，其发生缺陷后，与肿瘤发生的易感性密切相关。目前研究表明，NQO1蛋白在恶性肿瘤中呈高表达，并与患者的不良预后紧密相连，但其在胃癌组织中的报道较少。β-拉帕醌（β-lapachone）是NQO1蛋白的一种有效抑制剂，提取于中南美洲的天然产物紫檀树的树皮，研究表明，β-拉帕醌可诱导前列腺癌、乳腺癌、白血病等多种肿瘤细胞的凋亡，也可作为一种治疗结肠癌和前列腺癌的放射增敏剂，但其在胃癌中的作用和机制尚不清楚。因此，深入研究NQO1蛋白及其抑制剂β-拉帕醌在胃癌预后评估及靶向治疗中的作用具有重要的临床指导意义。
　　研究目的：探讨NQO1蛋白在胃癌组织中过表达的临床病理学意义，并通过体外分子生物学实验研究NQO1抑制剂β-拉帕醌对SGC-7901和AGS胃癌细胞生物学行为的影响，分析其杀伤胃癌细胞的作用及分子机制，为胃癌的临床靶向治疗及预后评估提供新的靶点。
　　材料和方法：应用免疫组化方法在53例癌旁正常组织、31例胃黏膜不典型增生组织和203例胃癌（GAC）组织中检测NQO1蛋白的表达情况，并应用qRT-PCR法对比分析12例新鲜胃癌、8例癌旁及7例正常胃黏膜上皮组织中NQO1的mRNA表达情况，分析NQO1异常表达与胃癌临床病理学特征之间的相关性，生存期分析验证NQO1对患者预后评估的价值。传代培养 SGC-7901和 AGS胃癌细胞株；噻唑蓝（MTT）及平板克隆实验检测β-拉帕醌对细胞增殖的抑制作用；Hoechst33342染色和流式细胞术检测药物处理后的SGC-7901和AGS细胞凋亡率的变化；通过划痕实验检测β-拉帕醌抑制SGC-7901和AGS细胞迁移的能力；Western-blot法检测β-拉帕醌对SGC-7901和AGS细胞NQO1蛋白和增殖、凋亡、EMT标志物及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响。
　　结果：1.胃癌新鲜组织qRT-PCR方法检测显示，胃癌组织中NQO1的mRNA水平明显高于癌旁正常组织；免疫组化结果亦表明，NQO1蛋白表达阳性率和强阳性率（75.86％、61.58%）明显高于胃不典型增生组织（54.84%、38.71%）及癌旁正常胃黏膜组织（39.62%、26.42%）（P<0.05）；NQO1蛋白表达水平与胃癌患者肿瘤大小、临床分期和有无浆膜浸润密切相关。生存期分析显示，NQO1过表达患者的无瘤生存期及五年生存期均低于NQO1低表达者（P<0.01）；NQO1蛋白表达检测联合肿瘤大小、分化程度、临床分期、淋巴结转移和浆膜浸润检查可影响胃癌患者的总生存率，而多因素分析结果则表明，只有临床分期是胃癌不良预后的独立风险因子（HR:1.807,P=0.000）；2.MTT实验与平板克隆实验结果表明，β-拉帕醌（浓度为4μM）给药处理后，SGC-7901和 AGS细胞的增殖能力明显下降（P均<0.05），Western blot结果显示，β-拉帕醌通过下调Skp2和DEK蛋白的表达调节参与胃癌细胞增殖调控。另外，Hoechst33342染色结果显示，β-拉帕醌（浓度为4μM）给药处理后，胃癌细胞凋亡数量明显增加；流式细胞仪检测也发现，β-拉帕醌主要促进胃癌细胞的晚期凋亡（P<0.05）。Western blot结果显示，β-拉帕醌诱导凋亡主要是通过下调Bcl-2/Bax比值以及上调活化型 caspase-3/8/9的表达而实现的。划痕实验结果还显示，β-拉帕醌（浓度为4μM）可以明显抑制SGC-7901与AGS细胞的迁移能力（P<0.05），而且Western blot和免疫荧光染色结果表明，β-拉帕醌主要通过下调迁移相关蛋白MMP-2/9和Ezrin蛋白以及上皮间质转化（EMT）间质标记物Snail、Vimentin、GSK-3β等的表达水平、上调EMT上皮标志物E-cadherin表达影响SGC-7901与AGS细胞的迁移能力；3.β-拉帕醌可以下调SGC-7901与AGS细胞中PI3K/Akt/mTOR相关信号通路蛋白p-AKT和p-PTEN的表达。
　　结论：1. NQO1蛋白表达水平与胃癌患者预后密切相关，可能成为胃癌不良预后的有效分子标志物；2.β-拉帕醌可以体外抑制胃癌细胞增殖和迁移能力，并诱导细胞凋亡。其分子机制主要是：通过下调Skp2和DEK蛋白的表达抑制SGC-7901和AGS胃癌细胞的增殖；通过 MMPs和 EMT途径抑制胃癌细胞的迁移能力；同时，通过线粒体途径和caspase依赖途径诱导胃癌细胞凋亡增加；3. PI3K/Akt/mTOR通路可能参与了β-拉帕醌体外杀伤胃癌细胞的分子作用途径。

目录

声明

缩略词

1研究背景

2材料与方法

2.1 临床资料

2.2 实验方法

3 结果

3.1 NQO1蛋白在胃癌组织中明显高表达

3.2 NQO1蛋白过表达与胃癌临床生物学行为特点之间的关系

3.3 NQO1蛋白过表达与胃癌患者生存期的相关性

3.4 Cox比例风险模型分析胃癌患者生存期的影响因素

3.5 NQO1蛋白过表达在早期和晚期胃癌患者生存期分析中的相关性

3.6 β-拉帕醌抑制胃癌细胞增殖的作用及机制

3.7 β-拉帕醌抑制SGC-7901和AGS胃癌细胞中NQO1蛋白的表达

3.8 β-拉帕醌通过caspase依赖途径诱导SGC7901和AGS胃癌细胞的凋亡

3.9 β-拉帕醌通过抑制EMT降低胃癌细胞的侵袭转移能力

3.10β-拉帕醌通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路体外杀伤胃癌细胞

4. 讨论

4.1 NQO1高表达与胃癌的预后密切相关，可能成为胃癌不良预后的有效分子标志物

4.2 β-拉帕醌通过下调Skp2和DEK蛋白表达抑制SGC-7901和AGS胃癌细胞的增殖

4.3 β-拉帕醌体外抑制胃癌细胞的侵袭与迁移能力

4.4β-拉帕醌体外诱导胃癌细胞的凋亡

4.5 PI3K/Akt/mTOR通路参与了β-拉帕醌体外杀伤胃癌细胞的分子机制

5 结论

参考文献

攻读博士学位期间的科研业绩

综述:胃癌分子靶向治疗的研究进展

2 胃癌的分子靶向治疗

3 结语与展望

参考文献