气肿疽梭菌Dot-ELISA方法的建立及初步应用

摘要

气肿疽梭菌（Closridiumchauvoei）是一种产芽孢的梭状杆菌，产生的芽孢可长期存活在土壤中，经消化道或粘膜侵入机体，引起恶性水肿和气性坏疽等症状，具有传染性，可以感染人。针对该病的诊断尚无标准的血清学检测技术。因此，本研究旨在以制备的标准阳性血清为抗体建立一种快速、简便而且灵敏的血清学诊断方法，为日后气肿疽诊断制剂的研制奠定理论与实践基础。
　　本试验成功的纯化了由气肿疽梭菌标准株 C54-1的提取的有效抗原，以特异性最强的纯化抗原免疫豚鼠，经四次免疫后获得的血清以1000倍稀释后，用ELISA法检测其 OD450nm值达1.6以上，并经 Dot-ELISA方法重复性试验研究表明，该血清特异性和稳定性优良，可作为气肿疽梭菌双抗体夹心Dot-ELISA方法的一抗用于检测。
　　筛选最适反应条件是Dot-ELISA试验的重点。通过反复优化，确定抗体最佳稀释度为1:1024；可检测到最低菌体抗原量为3.125μg，最低分泌抗原量为1.89μg；最适酶标二抗浓度为1:4000。采用双抗体夹心 Dot-ELISA方法、AGID法和 PCR法同时检测30只致病豚鼠肝脏和脾脏碾磨液，结果 Dot–ELISA方法与PCR法阳性符合率为93.3％，阳性检出率是 AGID法的2.5倍，表明该方法灵敏度很高。用试验建立的双抗体夹心Dot-ELISA检测实验室已确诊病料，30份阳性样本中检出26份阳性结果，远远高于 AGID法的检出率，证明该方法准确性较高。
　　本试验是国内首次应用标准株气肿疽梭菌纯化抗原免疫 SPF豚鼠制备的标准血清为一抗包被载体膜，建立了快速检测气肿疽病原体毒素的双抗体夹心 Dot-ELISA诊断方法，该方法较 ELISA法有更高的特异性和敏感性，可以检测到微量气肿疽梭菌毒素，且抗体用量少、易于保存、不需要特殊仪器、操作方便快捷，有望生产为试剂盒应用于临床实践对气肿疽的快速检测。

目录

声明

前言

1 病原体简介

2 流行病学及临床症状特征

3 实验室诊断方法

4 气肿疽的危害

5 防治措施

6 Dot-ELISA简介

7 本试验研究的目的及意义

材料与方法

1 材 料

2方 法

结果

1 气肿疽梭菌培养结果

2 气肿疽梭菌生长曲线的测定

3 初提抗原的制备及被检抗原含量测定

4 气肿疽梭菌纯化抗原的洗脱曲线

5 纯化抗原 SDS-PAGE分析

6 纯化抗原 W estern blot 分析

7 气肿疽梭菌标准血清制备结果

8 Dot-ELISA 的判定标准

9 Dot-ELISA程序的优化

10 特异性试验

11重复性试验

12 敏感性试验

13 比较试验

14 快诊膜对已知病牛样本的检测

15诊断膜的保存期试验

讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介