高产GABA乳酸菌的筛选应用及包被GABA瘤胃稳定性和对延边黄牛血液相关指标的影响

摘要

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是生物体内谷氨酸在谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD)的作用下进行脱羧，形成的一种广泛存在于自然界，具有抑制神经传递的非蛋白质氨基酸。GABA参与体内多种代谢活动，对动物具有抗应激、调节激素分泌、改善胴体品质、提高繁殖性能等作用。乳酸菌是含有GAD的一种国际公认的有益菌，利用乳酸菌和其GAD进行GABA的富集是生产中的一个重要途径，本试验主要研究筛选具有高产GABA能力的乳酸菌，将其GAD应用于畜牧业饲料添加剂GABA的生产，并运用GABA到延边黄牛中，为乳酸菌的应用和GAD运用于饲料添加剂GABA的生产同时为GABA在延边黄牛中的应用提供理论依据。本论文主要包括以下几方面的研究。
　　1.高产γ-氨基丁酸乳酸菌的分离筛选及初步鉴定
　　本章利用梯度稀释法和纸层析法从辣白菜、酸菜、酸奶中分离筛选出具有GABA合成能力的乳酸菌，利用高效液相色谱(HPLC)法对乳酸菌发酵液中GABA的含量进行测定，并对具有较高合成GABA能力的乳酸菌进行初步鉴定，结果发现从酸菜分离筛选的乳酸菌B1产GABA量最高，可达3.121g/L。
　　2.高产GABA乳酸菌发酵米糠生产γ-氨基丁酸的条件优化研究
　　利用乳酸菌发酵廉价农副产品米糠，研究单因素发酵温度、发酵时间、菌液添加量、磷酸吡哆醛(PLP)浓度、氯化钙(Cacl2)浓度对米糠发酵液中GABA含量的影响。在单因素试验的基础上采用正交分析法对发酵米糠条件进行优化，确定乳酸菌发酵米糠富集GABA的最优条件为发酵溶液中PLP浓度为0.10mmol/LCacl2浓度为1.5mmol/L，菌液添加量为3.5％(V/V)，发酵时间为24h时，米糠发酵液中GABA含量可达335mg/100g。
　　3.谷氨酸脱羧酶酶学性质研究及在饲料添加剂中的应用
　　以乳酸菌B1为研究菌种，研究温度、pH、磷酸吡哆醛、金属离子等与GAD活性的关系以及乳酸菌B1的Vmax和Km值，确定GAD活性最大时所需要的温度、pH等，然后利用GAD和L-谷氨酸的脱羧反应生成GABA来进行饲料添加剂GABA的生产，结果得出乳酸菌B1的GAD最适温度为40℃，在30-50℃范围内稳定性良好;最适pH为4.5，pH在3.5-5.5时稳定性良好;PLP和VB6浓度为0.05mmol/L时，酶活力最大;Ca2+、Mg2+、Mn2+对酶活有激活作用，SDS、I-、Ag+、Cl-、CH3COOH、EDTA对酶活有抑制作用;对底物的Km=0.0601mmol/LVmax=1.98μmol/min;利用GAD的酶学性质进行饲料添加剂GABA的制备，试验可行性强，GABA的含量可达8.96％(w/w)。
　　4.γ-氨基丁酸的稳定性研究及对延边黄牛整肠消化率、内分泌激素、免疫指标、抗氧化能力和血常规的影响
　　4.1包被GABA的过瘤胃特性研究
　　主要对两种不同材料包被的GABA进行体内瘤胃降解率试验和体外瘤胃后释放试验，发现它们在瘤胃中的降解率在24h的时候分别为20.97％和24.91％，瘤胃后释放率在12h的时候均达到90％以上，综合比较，表明用棕榈酸包被制成的GABA更适合运用于延边黄牛。
　　4.2γ-氨基丁酸对延边黄牛整肠消化率、内分泌激素、免疫指标、抗氧化能力和血常规的影响
　　在延边黄牛基础日粮中添加包被GABA，结果表明GABA对延边黄牛整肠消化率没有影响。与对照组相比，对于皮质醇(COR)，试验组Ⅰ显著降低了其浓度(P＜0.05);试验组Ⅱ极显著降低了其浓度(P＜0.01)，试验组Ⅱ显著小于试验组Ⅰ(P＜0.05)。对于促肾上腺皮质激素(ACTH)，试验组Ⅰ和试验组Ⅱ都显著降低了其浓度(P＜0.05);对于免疫指标，试验组Ⅰ和试验组Ⅱ都极显著增加了lg A和lg G的浓度(P＜0.01)，但对lg M的浓度无显著影响(P＞0.05);试验组Ⅰ和试验组Ⅱ都显著增加了IL-2的浓度(P＜0.05);对于抗氧化指标，试验组Ⅰ和试验组Ⅱ都可以显著降低MDA的浓度(P＜0.05)，极显著增加GSH-Px的活性(P＜0.01)，试验组Ⅱ显著大于试验组Ⅰ的活性(P＜0.05)，对SOD活性的影响不显著(P＞0.05);对于血常规，试验组Ⅰ和试验组Ⅱ都可以显著增加平均红细胞体积(P＜0.05)，极显著增加血小板的数量(P＜0.01)，试验组Ⅱ显著大于试验组Ⅰ(P＜0.05)。在本试验中，适宜添加量为55g/d/head。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 氨基丁酸(QABA)的简介

1．1．1 GABA的发现

1．1．2 GABA的结构

1．2 GABA对动物的作用

1．2．1 提高动物采食量

1．2．2 增强动物的免疫功能

1．2．3 提高动物抗缺氧能力

1．2．4 提高动物抗热应激的能力

1．3 GABA在畜牧业中的应用

1．4 GABA的合成方法

1．4．1 化学合成法

1．4．2 植物毒集法

1．4．3 微生物发酵法

1．5 微生物合成GABA的代谢途径及影响因素

1．5．1 微生物合成卧队的代谢途径

1．5．2 影响微生物合成GABA的因素

1．6 分离的乳酸菌合成GABA研究概况

1．6．1 国内外分离乳酸菌合成GABA研究状况

1．6．2 对产GABA乳酸菌发酵条件优化的研究

1．7 乳酸菌谷氨酸脱羧酶研究进展

1．7．1 GAD的结构简介

1．7．2 谷氨酸脱羧酶学性质研究

1．8 立题目意义

1．9 研究目的与内容

第二章 高产γ-氨基丁酸乳酸菌的分离筛选及初步鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料及药品

2．1．2 培养基

2．1．3 试验仪器

2．1．4 试验方法

2．2 结果与讨论

2．2．1 分离菌种的初步鉴定

2．2．2 产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选结果

2．2．3 高产GABA乳酸菌的初步鉴定

2．3 本章小结

第三章 高产GABA乳酸菌发酵米糠生产γ-氨基丁酸的条件优化研究

3．1 材料与方法

3．1．1 材料与试剂

3．1．2 试验仪器

3．1．3 菌种与培养基

3．1．4 乳酸菌传代、活化

3．1．5 GABA含量的测定

3．1．5 发酵条件的优化

3．2 结果与讨论

3．2．1 标准曲线

3．2．2 发酵温度的影响

3．2．3 发酵时间的影响

3．2．4 菌液添加量的影响

3．2．5 PLP的影响

3．2．6 氯化钙的影响

3．2．7 正交试验结果

3．2．8 验证试验结果

3．3 本章小结

第四章 乳酸菌酶学性质的研究及富含GABA饲料添加剂的制作

4．1 材料与方法

4．1．1 材科与试剂

4．1．2 试验仪器

4．1．3 试验方法

4．2 结果与讨论

4．2．1 温度对酶活力的影响

4．2．2 酶的耐热性

4．2．3 pH对酶活力的影响以及酶的耐pH

4．2．4 PLP和VB6对酶活力的影响

4．2．5 不同金属离子和化学物质对酶活力的影响

4．2．6 乳酸茵动力学常数测定

4．2．7 含GABA 制作

4．3 本章小结

第五章 γ-氨基丁酸的稳定性研究及对延边黄牛整肠消化率、内分泌激素、免疫指标、抗氧化能力和血常规的影响

第一节 包被GABA的过瘤胃特性研究

1．1 材料与方法

1．2 结果与分析

1．3 讨论

1．4 小结

第二节 γ-氨基丁酸对延边黄牛整肠消化率、内分泌激素、免疫指标、抗氧化能力和血常规的影响

2．1 材料与方法

2．2 结果与分析

2．3 讨论与小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

致谢