新生的肌肉生长抑制素基因单侧敲除猪肌肉特性的研究

摘要

肌肉生长抑制素基因(Myo statin，MSTN)作为骨骼肌生长发育的负调控因子，对骨骼肌的生长具有抑制作用。MSTN基因自然突变的现象已经在牛、羊、狗等动物中发现，均表现为肌肉肥大。研究发现，MSTN基因突变能够增加卵泡抑素基因(Follistatin)的表达水平，并潜在地改变肌肉中肌纤维类型的分布和肌球蛋白重链的表达水平。目前，MSTN基因单侧突变动物的研究相对较少。猪作为研究人类骨骼肌生理功能最适宜的动物模型，其解剖学和生理学特性与人类是非常相似的。因此，本研究结合体细胞核移植和胚胎移植技术，利用已建立好的MSTN基因单侧敲除猪(MSTN+/-)细胞系，生产雄性的MSTN+/-猪，探索MSTN基因单侧敲除对猪半腱肌和半膜肌的肌肉重量、肌纤维横断面积和数量、肌纤维类型的分布以及肌球蛋白重链亚型的表达的影响。主要实验内容及结果如下:
　　1、生产MSTN+/-猪。利用已通过转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)打靶技术建立的MSTN基因单侧敲除猪胎儿成纤维细胞系（MSTN基因单链缺失5-bp），经过体细胞核移植技术获得MSTN+/-重构胚，与野生型(WT)供体细胞获得的重构胚胎对比，二者具有相似的分裂率、囊胚形成率和囊胚细胞数。将MSTN+/-克隆胚胎移植到代孕母猪体内获得MSTN+/-仔猪。并发现MSTN基因单侧敲除降低新生猪半腱肌和半膜肌中的MSTN基因的表达水平，并提高Follistatin基因的表达水平(P＜0.05)。
　　2、检测新生的MSTN+/-猪半腱肌和半膜肌的组织形态学特性。取材发现，MSTN+/-猪的半腱肌和半膜肌的肌肉横断面积较WT猪大。与WT猪相比，MSTN+/-猪两种肌肉的绝对肌肉重量和相对肌肉重量均明显提高(P＜0.05)。对新生的MSTN+/-猪和WT猪的半腱肌和半膜肌组织切片进行苏木精伊红染色，在MSTN+/-猪中，两种肌肉的肌纤维横断面面积明显高于WT猪，但MSTN+/-猪和WT型猪半腱肌和半膜肌的肌纤维数量均无显著性差异。结果表明，新生的MSTN+/-猪肌肉质量的提高，主要是MSTN单侧敲除使肌纤维肥大导致的。
　　3、观察肌纤维类型的分布。试验利用免疫荧光染色法标记肌球蛋白重链Ⅰ型蛋白，在MSTN+/-猪中，半腱肌和半膜肌慢肌纤维比例明显低于WT猪(P＜0.05)。进一步进行琥珀酸脱氢酶染色，发现在相同条件下染色，MSTN+/-猪两种肌肉与WT猪相比呈现更低的琥珀酸脱氢酶活性，可推测MSTN+/-猪拥有更多的快酵解型肌纤维。结果表明，MSTN基因单侧敲除能够改变新生猪肌纤维类型的分布，提高快酵解型肌纤维的比例。
　　4、比较肌球蛋白重链亚型的表达水平。试验通过实时定量PCR方法，检测MSTN+/-猪的半腱肌和半膜肌中肌纤维类型相关基因，肌球蛋白重链Ⅰ型(MHCI)、ⅡA型(MHCⅡA)、ⅡB型(MHCⅡB)的表达水平。结果发现，在MSTN+/-猪的半腱肌和半膜肌中，MHCⅡB基因表达水平明显高于WT猪(P＜0.05)，MHCⅡA基因表达水平在两组中无显著差异，MHCI基因表达水平仅在半腱肌中高于WT猪，说明MSTN+/-猪肌纤维类型向快酵解型纤维转变。
　　上述结果表明，猪MSTN单侧敲除重构胚具有与WT供体细胞重构胚具有相似的体内外发育能力，MSTN单侧敲除能够显著降低新生猪半腱肌和半膜肌的MSTN基因的表达水平，提高Follistatin基因的表达水平。新生的MSTN+/-猪的体重、半腱肌和半膜肌的肌肉重高于WT猪，主要是由于MSTN单侧敲除增加肌纤维大小导致的。除此之外，MSTN单侧敲除改变新生猪半腱肌和半膜肌肌纤维类型的分布，提高快肌纤维的比例和肌球蛋白重链ⅡB型基因的表达量，降低琥珀酸脱氢酶的活性，使肌纤维类型向酵解型纤维转变。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 肌肉生长抑制素基因的研究进展

1．1．1 肌肉生长抑制素基因的发现

1．1．2 Myostatin基因的结构

1．1．3 Myostatin基因的表达及作用机制

1．2 Myostatin基因与动物肌肉表型的关系

1．3 Myostatin基因与骨骼肌肌纤维类型分布的关系

1．3．1 骨骼肌肌纤维类型的划分

1．3．2 Myostatin基因突变骨骼肌肌纤维类型的分布

1．3．3 Myostatin基因突变对运动能力的影响

1．4 Myostatin基因突变的应用前景

1．5 本试验的研究目的与意义

2．1．1 试验时间与地点

2．1．2 试验材料

2．1．3 试验主要药品

2．1．4 试验主要仪器设备

2．2 试验药品配制与试验方法

2．2．1 试验药品配制

2．2．2 试验方法

2．3 试验设计

2．3．4 鉴定新生的MSTN+／-猪肌纤维类型的变化

2．4 统计分析

第三章 结果与分析

3．2 检测新生的MSTN+／-猪肌肉中MSTN和Follistatin基因的表达水平

3．3 鉴定新生的MSTN+／-猪的肌肉重量及肌纤维大小和数量的变化

3．3．2 比较新生的MSTN+／-猪和WT猪肌纤维大小和数量的差异

3．4 鉴定新生的MSTN+／-猪半腱肌和半膜肌肌纤维类型的变化

3．4．1 比较新生的MSTN+／-猪和WT猪肌纤维类型的分布

3．4．2 比较新生的MSTN+／-猪和WT猪肌肉中MHCⅠ、MHCⅡA、MHCⅡB的表达水平

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

附录