虫草素靶向DEK调控Akt及Erk1/2信号通路抑制胆管癌增殖和迁移的机制研究

摘要

目的:探讨虫草素(Cordycepin)对胆管癌细胞增殖和迁移的抑制作用及其分子机制。
　　材料和方法:MTT法检测不同浓度虫草素对胆管癌细胞活力的抑制作用;平板克隆形成实验检测虫草素对胆管癌细胞集落形成能力的影响;Hoechst33342染色观察虫草素处理后的细胞内凋亡小体的形成情况;AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测虫草素用药后的细胞凋亡率;划痕愈合实验和Transwell小室迁移实验检测虫草素对胆管癌细胞迁移能力的影响;免疫荧光染色法检测虫草素处理后胆管癌细胞E-Cadherin和Vimentin的表达情况;蛋白印迹实验检测凋亡相关蛋白、EMT标志物蛋白、Akt信号通路和Erk1/2信号通路相关蛋白及DEK蛋白的表达水平;DEK基因沉默后检测胆管癌细胞增殖活力、克隆形成能力和迁移能力;RT-PCR实验检测正常胆管及多种胆管癌细胞系中DEK的mRNA表达水平;免疫组织化学染色法检测人胆管癌组织中DEK和裸鼠荷瘤中E-Cadherin、Vimentin、p-Akt、p-Erk1/2及DEK的表达水平;裸鼠荷瘤实验检测虫草素在体内对胆管癌的抑制作用。
　　结果:1 MTT实验结果显示:用0μM、25μM、50μM、100μM、200μM的虫草素处理胆管癌HuCCT1细胞，用0μM、375μM、75μM、150μM、300μM的虫草素处理胆管癌CCKS1细胞分别作用24 h、48 h、72 h后，与对照组相比，虫草素处理组的细胞活力明显被抑制，并且呈时间-剂量依赖性(P＜0.05);2平板克隆形成实验结果显示:分别用不同浓度虫草素处理胆管癌细胞14d后，与对照组相比，虫草素处理组的细胞集落形成能力显著受到抑制，且呈剂量依赖性(P＜005);3 Hoechst33342染色结果显示:经100μM虫草素处理HuCCT1和150μM虫草素处理CCKS1.48 h后与对照组相比，呈亮蓝色的细胞核明显增多;4 AnnexmⅤ/PI双染流式细胞仪检测结果显示:经虫草素处理后的胆管癌细胞中，与对照组相比，其细胞凋亡率显著升高(P＜0.05);5划痕愈合实验结果显示:用不同浓度虫草素处理胆管癌细胞12h后，与对照组相比，虫草素处理组的细胞横向迁移距离明显缩短，且呈剂量依赖性（P＜0.05）;6 Transwell小室迁移实验结果显示:经虫草素处理12h后，与对照组相比，其纵向迁移能力受到显著抑制(P＜005);7免疫荧光染色实验结果显示:经虫草素处理24 h后，与对照组相比，E-Cadherin的表达水平升高，Vimentin的表达水平降低;8.蛋白印迹实验结果显示:与对照组相比，虫草素处理组的凋亡相关蛋白Cleaved caspase9、Cleaved caspase3和Cleaved PARP的表达上调;EMT标志物蛋白E-Cadherin的表达上调，Vimentin、Snail、Slug、MMP9的表达下调;Akt信号通路相关蛋白Akt和4EBP1以及Erk1/2信号通路相关蛋白Erk1/2的磷酸化水平下降，其相关总蛋白的表达量并无明显变化;DEK的表达量显著下降;9免疫组织化学染色结果显示，与癌旁组织相比，DEK在人胆管癌组织中的表达水平显著升高;10 RT-PCR实验结果显示，胆管癌细胞中的DEK表达水平显著高于正常胆管上皮细胞;11 DEK基因沉默明显抑制胆管癌细胞活力、克隆形成能力及迁移能力(P＜005);12 DEK基因沉默显著抑制Akt和Erk1/2蛋白的磷酸化水平，应用了Akt抑制剂Akti-1/2和Erk1/2抑制剂GDC-0994后，DEK蛋白表达无明显差异。13裸鼠荷瘤实验结果显示:与对照组相比，虫草素用药组的裸鼠体重无明显差异，而其相对肿瘤大小在给药第9天开始具有显著差异（P＜0.05）;14免疫组织化学染色结果显示，与对照组相比，虫草素用药组中E-Cadherin、Vimentin、p-Akt、p-Erk1/2及DEK的表达量减少。
　　结论:1虫草素抑制胆管癌细胞增殖和迁移与诱导细胞凋亡及抑制EMT的发生相关;2虫草素抑制胆管癌细胞增殖和迁移与抑制Akt和Erk1/2信号通路相关;3虫草素靶向DEK调控Akt和Erk1/2信号通路抑制胆管癌的增殖和迁移。

目录

声明

摘要

英文缩写

第一章 前言

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 统计学方法

第三章 结果

3．1 虫草素显著抑制胆管癌细胞增殖活力和克隆形成能力

3．2 虫草素诱导胆管癌细胞凋亡

3．3 虫草素抑制胆管癌细胞的迁移能力

3．4 虫草素抑制胆管癌细胞EMT的发生

3．5 虫草素抑制Akt和Erk1／2信号通路

3．6 DEK在各肿瘤中的表达及虫草素对DEK蛋白的影响

3．7 DEK在胆管癌中过表达

3．8 DEK基因沉默抑制胆管癌细胞增殖和迁移

3．9 DEK基因沉默抑制Akt和Erk1／2信号通路

3．10 虫草素对裸鼠荷瘤的影响

3．11 虫草素对裸鼠荷瘤蛋白表达的影响

3．12 全文机制图

附图

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

攻读硕士学位期间取得的科研业绩

致谢