人参皂苷CK通过TGF-β1/Smads通路诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用机制

摘要

目的：探讨人参皂苷CK(Ginsenoside CK)通过TGF-β1/Smads通路诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及其作用机制，为人参皂苷CK治疗肝癌的研究提供理论依据。
　　方法：常规培养人肝癌SMMC-7721细胞，分为对照组和实验组;利用MTT法检测不同浓度人参皂苷CK(20，40，60，80μmol/L)作用于细胞的存活率;利用Hoechst染色和流式细胞术检测不同浓度人参皂苷CK（20，40，60μmol/L）对人肝癌SMMC-7721的凋亡作用;利用免疫细胞化学染色法检测TGF-β1/Smads通路相关蛋白TβRⅡ、Smad4的表达;进一步利用Western Blot技术检测TGF-β1/Smads通路相关蛋白TGF-β1、TβRⅡ、Smad2/3、Smad4、Smad7及凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3的表达;利用Western Blot技术检测加入人重组蛋白TGF-β1后，人参皂苷CK组的TGF-β1/Smads通路相关蛋白Smad2/3、Smad4和Smad7蛋白的表达。
　　结果：
　　1.人参皂苷CK能降低人肝癌SMMC-7721细胞存活率，并且随着药物浓度和作用时间的增加，抑制增殖作用明显，且呈一定的时间和浓度依赖性，计算药物作用48h后对SMMC-7721细胞的存活率(％)分别为88.0±8.1，57.0±6.6，34.2±5.6，10.0±5.9;
　　2.人参皂苷CK作用后，Hoechst荧光染色法检测人肝癌SMMC-7721细胞出现大量蓝白荧光深色细胞，发生凋亡，Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3表达显著升高;
　　3.流式细胞术检测，人参皂苷CK(20，40，60μmol/L)对人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡率(％)分别为7.2±1.2、23.5±2.1、46.2±1.2;
　　4.免疫细胞化学染色检测，人参皂苷CK作用后，随着药物浓度的增加Smad4表达升高;
　　5.Western Blot结果显示，对照组细胞TGF-β1、TβRⅡ、Smad2/3、Smad4表达水平较高，Smad7表达水平较低，随着药物作用浓度的增加，TGF-β1、TβRⅡ、Smad2/3、Smad4表达量逐渐降低，而Smad7的表达量逐渐升高;加入人重组蛋白TGF-β1(10 ng/ml)作用后，与人参皂苷CK（60μmol/L）组比较，TGF-β1+人参皂苷CK组的Smad2/3和Smad4表达上升，Smad7表达下降;
　　结论：人参皂苷CK可以诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡;TGF-β1/Smads通路途径可能是其诱导细胞凋亡的作用机制之一。

目录

声明

前言

摘要

中英文缩略语

第一章 材料

1．1 实验仪器

1．2 实验试剂

1．3 实验抗体

1．4 实验细胞

第二章 方法

2．2 MTT实验

2．3 Hoechst染色

2．4 流式细胞仪检测试验(Annexin VFITC／PI双染)

2．5 免疫细胞化学染色检测Smad4蛋白的表达

2．6 Western Blot检测蛋白表达含量

2．6．1 提取细胞全蛋白

2．6．2 BCA法测定蛋白质含量

2．6．3 Western blot法检测蛋白的表达

2．7 数据处理及分析

第三章 结果

3．1．2 Hoechst检测人参皂苷CK诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡结果

3．1．3 流式细胞术检测人参皂苷CK诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡结果

3．1．4 Western Blot检测凋亡相关蛋白表达结果

3．2 人参皂苷CK作用于人肝癌SMMC-7721细胞对其TGF-β1／Smads通路蛋白表达影响的结果

3．2．1 免疫细胞化学法检测Smad4蛋白表达的结果

3．2．2 Western blot检测TGF-β1／Smads通路相关蛋白的表达结果

3．2．3 Western blot检测人重组蛋白TGF-β1对人参皂苷CK抑制TGF-β1／Smads通路表达的影响结果

第四章 讨论

第五章 结论

致谢

参考文献