一例自发性静脉血栓症家系蛋白C基因的初步研究

摘要

蛋白C是一种维生素K依赖性的丝氨酸蛋白酶,活化的蛋白C(Activated Protein C)可特异性失活凝血活化辅因子Ⅴ(Ⅴ<,α>)和Ⅷ(Ⅷ<,α>),在凝血-抗凝血系统中起着重要的调节作用.蛋白C基因异常或一些后天因素可造成蛋白C缺陷,其常与其它先天或后天危险因子共同作用引发静脉血栓的发生.我们发现了一个具有明显遗传倾向的自发性静脉血栓症家系,并试图在该家系中探索蛋白C基因是否存在异常.通过对该家系三代中7名成员的蛋白C基因的研究,经DNA测序共找到6个突变,其中5个为错义突变,均位于蛋白C外显子9编码区内即丝氨酸蛋白酶活性结构域内;另一个为缺失突变,位于外显子9的3'端UTR区(untranslated region).6个突变分别是T<,11066>→C(ATC→ACC,Ile<,407>→Thr),A<,10789>→G(ACC→GCC,Thr<,315>→Ala),A<,10598>→G,(AGC→GGC,Ser<,252>→Gly),G<,10645>→C(GCC→CCC,Ala<,267>→Pro),T<,10847>→C(GTC→GCC,Val<,334>→A1a)和A<,11172>缺失.其中T<,11066>→C(Ile<,407>→Thr)和A<,1 0598>→G(Ser<,252>→Gly)这两个突变均造成氨基酸侧链化学性质的剧烈变化,氢键数目及类型也发生明显变化,这种剧烈变化进而会影响蛋白质的空间构象自由能(conformational freedom),使蛋白C酶原分子不能正确折叠,导致蛋白C分子结构异常,不能被内质网或高尔基体上的下游作用蛋白识别,使得这些异常的蛋白C分子从内质网或高尔基体上脱落下来,来不及与分子伴侣结合完成分泌过程,因此长时间停留在细胞内,最终被降解掉.另外,蛋白C重链区结构类似球形,氨基酸侧链化学性质的剧烈变化也可能会引起相应氨基酸残基位置的移动,导致蛋白C分子局部结构发生异常,进而影响整个蛋白C分子的结构.综合以上分析结果和临床资料,我们认为这些突变中的T<,11066>→C(Ile<,407>→Thr)、A<,10598>→G(Ser<,252>→Gly)会对蛋白C分子的结构产生较为明显的影响,使之不能正确折叠,因而不能和相关的下游蛋白作用,不能正确合成并完成分泌过程,最终在细胞内被降解.A<,11172>缺失则可能使蛋白C mRNA前体的结构异常,引起3'端的剪切位点异常,导致mRNA和蛋白C合成异常,但这一推测尚需进一步的实验加以验证.我们认为这三个蛋白C异常可能是造成该家系下肢静脉血栓高发率的主要因素之一.该家系成员的蛋白C基因外显子9表现很强的易变性,这六个蛋白C基因突变均是首次报道.

目录

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第1章前言

1.1蛋白C的研究概况

1.1.1蛋白C生理学特性

1.1.2蛋白C缺陷

1.2蛋白C基因突变的研究进展

1.3蛋白C研究的目的及意义

第2章材料和方法

2.1实验材料

2.1.1家系

2.1.2血样

2.1.3菌株

2.1.4试剂

2.1.5溶液配制

2.1.6仪器

2.2实验方法

2.2.1基因组DNA提取

2.2.2引物设计

2.2.3目的基因片段的扩增

2.2.4凝胶电泳检测DNA片段

2.2.5 DNA片段回收

2.2.6限制性内切酶酶切鉴定

2.2.7大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.8连接反应

2.2.9转化

2.2.10克隆筛选与鉴定

2.2.11测序

2.2.12软件分析

第3章结果

3.1目的片段的扩增

3.1.1外显子9

3.1.2其它外显子

3.2限制性内切酶酶切鉴定

3.3 DNA测序结果与序列分析

3.3.1外显子9

3.3.2其它外显子

3.4蛋白C三维结构模拟结果与分析

第4章讨论

4.1测序结果与序列分析

4.1.1外显子9

4.1.2其它外显子

第5章结论

参考文献

附表

致谢