百脉根中脱氧葡萄糖筛选表达载体的构建和转录因子CBF1的转化研究

摘要

近年来，非生物胁迫特别是低温、干旱和盐害对农作物产量的影响日益严重，如何提高农作物抵抗不良外界环境的能力在农业生产上具有重要意义，而利用植物分子生物技术来提高植物的抗寒、抗旱和耐盐能力则是近几年研究的热点。随着抗寒新基因的不断发现，有不少关于转化抗寒相关基因并得到具有抗寒能力的转基因植株方面的报道。由于许多抗寒相关基因都受CBF转录激活因子的调控，因此导入此类转录激活因子基因提高植物的抗寒能力是一个新的思路。 在本研究中，首先在百脉根中建立了脱氧葡萄糖筛选系统，然后以CBF1为目的基因，分别构建了基于除草剂筛选和2-脱氧葡萄糖筛选的植物表达载体，并利用农杆菌转化的方法转到百脉根中。 主要取得以下研究结果： 1．基因的获得：依据GenBank数据库中发表的CBF1基因序列设计引物，以拟南芥基因组DNA为模板，利用PCR扩增得到目的片段。测序结果表明，目的片段与数据库中CBF1的基因序列完全相同；选择标记基因DOG<'R>1直接从植物表达载体pBinAR::DOGRl中利用SalI及EcoRI双酶切消化得到。 2．植物表达载体的构建：植物表达载体pCAMBIA3300-CBF1、pCAMBIA5300和pCAMBIA5300-CBF1中CBF1及DOG<'R>1基因的启动子均为CaMV35S。 3．百脉根中脱氧葡萄糖筛选系统的建立：当培养基中脱氧葡萄糖浓度高于600mg/L时，一部分子叶起初呈分化状态，但后来逐渐褐化死亡；培养基中脱氧葡萄糖浓度高于1000mg/L时，子叶基本上没有分化。 4．转基因百脉根的获得与检测：脱氧葡萄糖筛选系统的转化率基本与除草剂筛选系统相同。基于除草剂和脱氧葡萄糖筛选得到的转CBF1基因的百脉根植株在正常生长状况下，其脯氨酸含量比对照植株稍高，在4℃处理后转基因植株的脯氨酸含量明显比对照植株的高，并在12h时达到最高，说明CBF1基因能明显提高百脉根的脯氨酸含量，增强抗寒能力。 本研究首次在百脉根中建立脱氧葡萄糖筛选体系，并把转录激活因子基因CBF1转入到百脉根中，目的是研究CBF1基因是否能在百脉根中表达，并提高百脉根的抗寒能力和抵御其他不良环境的能力。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1 CBF1基因

1.1.1 CBF基因家族

1.1.2 CBF1蛋白的特性

1.1.3 CBF1转录激活因子对COR基因的表达调节

1.1.4 CBF基因的表达

1.2无选择标记基因转基因植物研究进展

1.2.1转座子介导

1.2.2位点特异性重组系统介导

1.2.3共转化

1.3脱氧葡萄糖筛选系统

1.4百脉根基因工程

1.5本研究的目的和意义

2.材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料：

2.1.2质粒和菌种

2.1.3试剂盒、酶类

2.1.4培养基

2.1.5实验所用引物

2.2实验方法

2.2.1基因的获得

2.2.2植物表达载体的构建

2.2.3植物表达载体转入到农杆菌中

2.2.4百脉根脱氧葡萄糖利用试验

2.2.5利用农杆菌转化百脉根

2.2.6转基因百脉根的检测

2.2.7转基因百脉根脯氨酸含量测定

3结果

3.1基因的获得

3.2植物表达载体的构建

3.2.1引物设计

3.2.2 TA克隆

3.2.3 CBF1测序的结果

3.2.4重组质粒pCAMBIA3300-CBF1的构建

3.2.5重组质粒pCAMBIA5300的构建

3.2.6表达载体pCAMBIA5300-CBF1的构建

3.3转基因百脉根的获得

3.3.1百脉根脱氧葡萄糖利用试验

3.3.2农杆菌介导的百脉根转化

3.4转基因百脉根植株的分子检测

3.5转基因百脉根植株的脯氨酸含量测定

3.5.1标准曲线

3.5.2样品脯氨酸含量测定

4.讨论

4.1利用脱氧葡萄糖筛选系统转化百脉根

4.2转CBF1基因到百脉根中的研究

5.结论

参考文献

致 谢