百脉根ERF类转录因子、其编码基因及表达载体和应用

摘要

本发明公开了百脉根ERF类转录因子、其编码基因及表达载体和应用。本发明从百脉根中分离得到ERF类转录因子cDNA，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。本发明还提供了含有该转录因子cDNA的表达载体及宿主细胞。功能分析实验证明，在植物中过表达ERF类转录因子cDNA能够有效提高或改善植物对包括高盐、干旱、低温等逆境胁迫的抗性。本发明进一步提供了它们在提高植物对逆境胁迫抗性或培育耐逆境胁迫转基因植物新品种中的应用，包括：构建含有所述ERF类转录因子cDNA的重组植物表达载体；将其转化到植物细胞中，培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物。

说明书

技术领域

本发明涉及转录因子，尤其涉及从百脉根(Lotus corniculatus L.)中分离的与抗逆相关的ERF类转录因子及其编码基因，本发明进一步涉及它们在提高植物抗逆境胁迫能力中的应用，属于ERF类转录因子及其应用领域。

背景技术

土壤干旱、盐碱化严重阻碍了农作物的生长，降低了农作物的产量，已经成为制约世界灌溉农业可持续发展和影响生态环境的重要因素。随着人口增加、耕地减少以及水资源的匮乏，提高水资源利用效率、充分开发和利用盐碱地有着极其重要的现实意义。盐碱地改良是世界性难题，传统措施投资大、效益低，经过数十年实践，利用基因工程技术提高植物抗旱、耐盐碱的能力，是开发利用干旱、盐碱地资源最根本、最经济、最有效的途径之一。

植物抗逆性是受多基因控制的复杂数量性状，单个基因表达的增强并不能从根本上改良植物对多种不良环境的抵抗能力，而转录因子(Transcriptional Factors,TFs)是能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件特异性结合，从而激活或抑制下游基因在特定时间和空间转录与表达的一类DNA结合蛋白，是目前抗逆研究最多、应用最广的一类基因。

植物逆境抗性相关转录因子可以分：AP2/ERF、bZIP、WRKY、MYB、NAC五大类。其中AP2/ERF转录因子是植物特有的一大类超基因家族，具有非常保守的DNA结合域，特异性的与ERE、GCC-box等顺式元件结合，调控胁迫应答基因表达，是参与植物生长发育、生物/非生物胁迫应答基因表达及信号转导的重要转录调控因子。其中DREB和ERF是首要的两大类亚家族，在生物/非生物胁迫应答中发挥至关重要的作用，是提高植物抗逆性能的理想候选基因。

目前已从不同物种中分离克隆了上千个DREB/ERF基因，对近200个基因进行了功能验证，转基因拟南芥、烟草等模式植物、水稻、玉米、大麦、小麦、大豆等粮食作物、番茄、马铃薯、辣椒、花生、棉花等经济作物、苜蓿、三叶草、高羊茅、百脉根等牧草中过表达在不同程度上提高了抗旱、耐盐、高温、冷冻、抗病虫等抗逆性能。尽管植物抗逆基因工程的研究取得了一些进展，但是其重点均在导入个别功能基因来提高某种抗性，从而达不到使植物的抗逆性得到综合、根本性的改良。

百脉根(Lotus corniculatus L.)是世界范围内广泛种植的多年生优良豆科牧草，具有营养丰富、耐贫瘠、耐酸碱、耐牧和饲用安全、适口性好等优点。百脉根不仅是建设生态农业的优质草种，还是用于土壤改良的重要作物，在用作地被植物、保持水土、改良人工草场、防止土壤荒漠化等方面具有独特作用。另外，百脉根在西方国家也常被作为路旁和庭院观赏植物而栽培。植物抗逆相关的ERF转录因子基因的分离、鉴定及其功能分析，对阐明抗逆分子机制、有效地进行分子育种研究十分必要。选择优质牧草百脉根为材料分离、鉴定AP2/ERF转录因子并分析其抗逆功能，对于农牧业生产、生态环境建设以及土壤改良等具有重要意义。

发明内容

本发明目的之一是提供从百脉根(Lotus corniculatus L.)中分离的ERF类转录因子及其编码基因。

本发明目的之二是提供含有上述编码基因的重组植物表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。

本发明目的之三是将所述的转录因子及其编码基因应用于提高或改善植物对于逆境胁迫的抗性。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

为实现上述目的，本发明一方面提供了一种从百脉根(Lotus corniculatus L.)所分离的ERF类转录因子cDNA(LcERF053)，其多核苷酸为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：

(a)、SEQ ID No.1所示的多核苷酸；或

(b)、编码SEQ ID No.2所示氨基酸的多核苷酸；或

(c)、与SEQ ID NO:1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有ERF类转录因子功能；或

(d)、与SEQ ID No.1所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸；或

(e)、在SEQ ID NO.1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有ERF类转录因子功能的功能或活性。

本发明目的之二是提供由上述转录因子cDNA(LcERF053)所编码的能够提高植物对逆境胁迫抗性的ERF类转录因子，其氨基酸为(a)或(b)所示:

(a)、SEQ ID No.2所示的氨基酸；

(b)、将SEQ ID No.2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有ERF类转录因子功能或活性的蛋白变体；

其中，SEQ ID NO.2的氨基端第100至163位氨基酸残基序列为AP2/ERF结合域的编码序列(SEQ ID No.3)，该结合域第14位(113位)氨基酸为丙氨酸(A)，第19位(118位)氨基酸为天冬氨酸(D)，此类结构域能够与GCC box顺式作用元件结合而启动抗病防卫基因或抗逆应答基因的表达。

本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备ERF转录因子的氨基酸序列变体或片段，其中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。

本发明所述的ERF转录因子及其编码基因包括天然存在的序列和变体两种形式。“变体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的仍编码SEQ ID No.2所示的氨基酸的多核苷酸变体，或者是通过重组的方法(例如DNA改组)。本领域技术人员可通过以下分子生物技术手段来筛选或评价变体多核苷酸所编码蛋白的功能或活性：DNA结合活性、蛋白之间的相互作用，瞬时研究中基因表达的激活情况或转基因植物中表达的效应等。

本发明还提供了含有所述ERF转录因子cDNA(LcERF053)的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。

将所述ERF转录因子cDNA可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该编码基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区，SEQ ID No.1所示的多核苷酸和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No.1所示的多核苷酸进行优化以增强或改善在植物中的表达效率。例如。可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强或改善在目标植物中的表达效率。

该重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

本发明还涉及将所述的ERF转录因子cDNA引入到植物中以提高植物对逆境胁迫的抗性。

本发明提供了一种提高植物对逆境胁迫抗性的方法，包括：将本发明从百脉根中分离的ERF转录因子cDNA引入到目标植物或植物细胞中，有效提高目标植物对逆境胁迫的抗性。

本发明还提供了一种培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种的方法，包括：构建含有所述从百脉根中分离的ERF转录因子cDNA的重组植物表达载体；将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中，培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物新品种。

其中，所述的逆境胁迫包括高盐、干旱、低温等逆境。

所述的“引入”指将ERF转录因子基因导入到植物细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到植物中。将所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法为本领域所习知，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法或病毒介导法等。“稳定转化”指被引入的多核苷酸构建体整合至植物细胞的基因组中并能通过其子代遗传；“瞬时转化”指多核苷酸被引入到植物中但只能在植物中暂时性表达或存在。

转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸或多肽引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本发明的ERF转录因子基因提供给植物。在其它实施方案中，本发明的ERF转录因子基因可通过将植物与病毒或病毒核酸接触来引入到植物中，通常，这样的方法涉及将本发明的ERF转录因子基因构建体引入病毒DNA或RNA分子中。

利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(McCormick et al.Plant Cell Reports.1986.5:81-84)。本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物。更优选的，所述的目标植物包括农作物、蔬菜或观赏植物、果树等，例如，可以是玉米、水稻、高粱、小麦、大豆、马铃薯、大麦、番茄、菜豆、花生、甘蔗或棉花等。

为了分析本发明从百脉根(Lotus corniculatus L.)中分离的ERF类转录因子cDNA(LcERF053)的功能，本发明首先构建了含有LcERF053基因的重组植物高效表达载体，利用农杆菌介导将其转化到拟南芥中；通过Hyg抗性、基因组PCR及RT-PCR筛选鉴定阳性苗，对转基因拟南芥苗进行高盐、干旱等抗逆性分析并且对其相关生理生化指标进行测定，通过测定生理生化指标分析看出，转LcERF053基因拟南芥植株的植株含水量、可溶性糖和脯氨酸等含量高于对照，这些渗透调节物质的大量积累有助于减少渗透胁迫和干旱胁迫对植物的伤害，说明过表达LcERF053基因能调节渗透调节物质的含量从而提高转基因拟南芥的抗旱性和渗透胁迫抗性。功能转化实验证明，在植物中过表达LcERF053基因能够有效提高或改善植物对包括高盐、干旱、低温等逆境胁迫的抗性，在提高植物抗逆反应中起着重要作用，说明LcERF053基因所编码的蛋白具有ERF类转录因子的功能。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“转录因子”是能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件特异性结合，从而激活或抑制下游基因在特定时间和空间转录与表达的一类DNA结合蛋白。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

本发明中所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(T_m)约5-10℃。T_m为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在T_m下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

本发明中所述的“多个”通常意味着2-8个，优选为2-4个，这取决于ERF转录因子三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“转化”：将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“编码序列”：转录成RNA的核酸序列。

术语“重组植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

附图说明

图1 LcERF053cDNA全长序列的扩增结果；M：DNA Marker 100bp，1：PCR产物。

图2 LcERF053结构保守域分析。

图3 LcERF053二级结构分析。

图4 进化起源分析。

图5 LcERF053在不同胁迫条件下的表达模式分析。

图6 植物表达载体pH7WG2D-LcERF053构建流程图。

图7 重组质粒pH7WG2D-LcERF053菌落PCR扩增结果。

图8 含有表达载体pH7WG2D-LcERF053的农杆菌GV3101的菌落PCR；M:100；+：阳性对照，-：农杆菌GV3101(阴性对照)。

图9 转LcERF053基因拟南芥的DNA水平的PCR检测结果；M:10000bpMarker；+：阳性对照，-：阴性对照。

图10 转LcERF053基因拟南芥的RNA水平的PCR检测；M:10000bp marker；+：阳性对照，-：阴性对照。

图11 盐胁迫下转基因LcERF053拟南芥以及野生型拟南芥的存活率。

图12 盐胁迫下转基因LcERF053拟南芥以及野生型拟南芥的相对含水量和电导率变化结果；Wt为野生型拟南芥；L4、L10和L12为转基因LcERF053拟南芥的不同株系。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 百脉根LcERF053转录因子的分离、鉴定与克隆

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料培养及胁迫处理

以百脉根-“Leo”为材料，选成熟饱满、无病虫害的种子，用0.1％升汞浸泡15-20min，无菌水冲洗3次，晾干，把消过毒的种子置于B5培养基上，于光照培养箱中培养30天，用150mM的氯化钠处理12h、24h，采集叶片立即液氮速冻，保存于-80℃冰箱中备用。

1.1.2 菌株与质粒

大肠杆菌(Escherichia coli)：DH5α  本发明人实验室保存

PMD19-T克隆载体                    购自TaKaRa生物公司

1.2 实验方法

1.2.1 百脉根总RNA的提取(试剂盒法)

1.2.2 第一链cDNA的合成(按天跟公司反转录试剂盒说明书进行)

1.2.3 ERF转录因子基因cDNA的克隆

1.2.3.1 引物的设计与合成

表1 克隆LcERF053cDNA全长的引物序列

1.2.3.2 RT-PCR

以用150mMNaCl处理12h、24h的叶片为材料提取总RNA进行RT-PCR，PCR条件为：94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。

1.2.3.3 PCR产物的回收

采用北京全式金生物技术有限公司的Easypure PCR Purification kit回收目的片段，按照试剂盒说明书的方法进行操作。

1.2.3.4 目的片段与克隆载体的连接

将回收的PCR产物连接至pMD19-T载体上，连接反应体系如表2，16℃连接过夜。

表2 连接反应体系

1.2.3.5 大肠杆菌感受态的制备

参照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克)一书中所列的具体方法进行。

1.2.3.6 大肠杆菌的转化(热激法)

参照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克)一书中所列的具体方法进行。

1.2.3.7 菌落PCR鉴定

以含有Amp的LB平板上挑取的白色单菌落，进行菌落培养并PCR验证，引物为LcERF053-F、LcERF053-R，扩增条件为：94℃3min，(94℃45sec，55℃45sec，72℃1min)30个循环，72℃10min。反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，并将筛选得到阳性克隆测序。

2实验结果与分析

2.1 LcERF053基因的克隆及其生物信息学分析

将扩增的百脉根ERF转录因子cDNA(图1)命名为LcERF053，全长cDNA序列为825bp(SEQID No.1)，开放阅读框含有825bp，没有内含子，即编码由274个氨基酸残基组成的蛋白LcERF053(SEQID No.2),其氨基端第100至163位氨基酸残基序列为AP2/ERF结合域的编码序列(SEQ ID No.3)，该结合域第14位(113位)氨基酸为丙氨酸(A)，第19位(118位)氨基酸为天冬氨酸(D)，此类结构域能够与GCC box顺式作用元件结合而启动抗病防卫基因或抗逆应答基因的表达。通过ExPASyCompute pI/Mw tool软件预测LcERF053蛋白等电点为5.15，分子量为29.6kDa；采用SignalP 4.1软件分析信号肽，结果显示：LcERF053蛋白没有信号肽，属于非分泌性蛋白；ProtScale软件分析疏水性、TMHMM软件分析跨膜结构，结果表明：LcERF053蛋白是亲水蛋白且没有跨膜结构。

LcERF053磷酸化位点分析：蛋白质在翻译后要经历各种共价修饰，如：可逆磷酸化、乙酰化、甲基化、糖基化等，而可逆磷酸化(磷酸化和去磷酸化)既是真核细胞内最常见的蛋白修饰方式，据估算真核细胞大约1/3以上蛋白都会被可逆磷酸化修饰；又是信号传导的重要级联系统，尤其是参与细胞间通讯和复杂功能的行使。

由于蛋白质的糖基化、酰基化、磷酸化都是蛋白质的化学修饰，提供蛋白功能信息，所以具有重要的生物学意义。一般认为：磷酸化的调节机制是通过促进或抑制转录因子与DNA结合特性来激活或抑制转录活性。因此，转录因子序列上的磷酸化位点对其行使转录激活或抑制起着重要的作用。采用Motif scan在线软件http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN/，分析LcERF053的氨基酸序列，分析预测结果(见表3)：LcERF053含有3个蛋白激酶C磷酸化位点，4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，1个N-酰基化位点和4个酪氨酸激酶磷酸化位点等；

表3 LcERF053磷酸化位点分析

亚细胞定位分析：核定位信号NLS是由4-8个短的碱性氨基酸序列，可使携带该段序列的蛋白定位于细胞核中，按照碱性氨基酸残基的分布规律，NLS分为三类：一元NLS，MAT e2类的NLS和双元NLS。一元NLS以SV40大T抗原NLS为代表，常常由一个短的碱性氨基酸序列(PKKKRKV)构成；双元NLS，由两个碱性氨基酸区域及两者之间的一段间隔氨基酸残基构成.第一个碱性区域一般含有两个碱性氨基酸残基，第二个区域至少含有3个碱性氨基酸残基，这类NLS可能是植物核蛋白所特有的广泛存在于植物核蛋白中；酵母MATa2类NLS，主要由短的疏水区域构成，但疏水区域中含有一个或几个碱性氨基酸残基(KIPIK)；或是非典型NLS；在序列构成上没有明显的特征，不成簇。

采用WoLF PSORT在线软件(http://psort.hgc.jp/)分析核定位信号，预测定位于细胞核。在第164位或165位分别含有一元核定位信号(NSL)，序列为：PPTKKQR或PTKKQRC，在第81位或82位含有双元核定位信号(NSL)，序列为：KKKSVVGSGGAGKKNAR或KKSVVGSGGAGKKNARK。

表4 LcERF053核定位信号预测分析结果

二级结构预测：采用HNN SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD在线软件：http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_hnn.html；分析二级结构，含有31.75％α-螺旋，8.03％β-折叠，60.22％无规则卷曲，见图3。

表5 LcERF053的二级结果分析

将LcERF053的氨基酸序列进行tblastn比对，结果显示，该转录因子全序列在蛋白质水平上与其他植物ERF类蛋白的同源性不高，一致性为62％，覆盖率为97％，这也说明此基因是新基因。用AP2结构域的氨基酸序列进行比对，

用MEGA5.0构建进化树(图4)，由图4看出，与苜蓿ERF同源性最高，从而可见不同物种中同一基因序列分子进化还是存在一定的差异，通过序列同源性的比对和系统进化树分析可以了解基因的进化以及生物系统发生的内在规律。

2.2 LcERF053基因在不同胁迫条件下的表达模式分析

对LcERF053基因在不同胁迫条件下进行表达模式分析，见图5，结果显示，150mM的NaCL处理12h，表达量提高了2.26倍，对激素6-BA、GA都有不同的应答，6-BA处理12h时，LcERF053的表达量下调至21.53倍；GA处理12h，表达量上调至9倍；由此看出，LcERF053对盐等非生物胁迫和6-BA、赤霉素等激素处理都有不同程度的应答，说明它可能参与了多种非生物胁迫及信号转导途径。

实施例2 含有LcERF053基因的植物表达载体的构建及其在拟南芥中的相关功能验证

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

拟南芥：哥伦比亚型，由本发明人实验室保存。

1.1.2 菌种及载体

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α，由本发明人实验室保存；农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404，本发明人实验室保存；pMD19-T克隆载体，购自TaKaRa；gateway入门载体pDNOR201和表达载体pH7WG2D购自invitrogen公司。

1.1.3 试剂

各种限制性内切酶、rTaq酶、ExTaq酶购自Takara公司；T4DNA连接酶购自Invitrogen公司；Taq酶购自北京全式金生物技术有限公司；Gel/PCR Extraction Kit购自BioMIGA公司。

1.1.4 培养基

1.1.4.1 YEB培养基：

参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法；

1.1.4.2 LB培养基：

参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法；

1.1.4.3 MS培养基：

参见实用植物组织培养技术教程(甘肃科学技术出版社)曹孜义主编所列的具体方法；

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计与合成

设计合成含有attb位点的引物。引物序列见表5。

表5 构建植物表达载体所用引物

1.2.2 植物表达载体的构建

1.2.2.1 植物高效表达载体pH7WG2D-LcERF053的构建

利用引物LcERF053-attb(F)和LcERF053-attb(R)从连接有全长LcERF053cDNA的pMD19-T载体上扩增出完整的开放阅读框。扩增产物和入门载体Pdnor201经BP反应，将pDNOR201载体上的CDDB基因替换为LcERF053基因，构建含有目的基因LcERF053的入门载体，转化大肠杆菌DH5α，PCR扩增筛选重组质粒，并测序鉴定。将经测序正确的入门载体pDNOR201-LcERF053与表达载体pH7WG2D进行LR反应，将表达载体上的CCDB基因替换为目的基因LcERF053，构建植物表达载体pH7WG2D-LcERF053，转化大肠杆菌DH5α，PCR扩增筛选重组质粒。

1.2.2.2 重组质粒的小量提取及酶切鉴定

质粒提取方法参照百泰克质粒小量制备试剂盒所列的具体方法；酶切鉴定TaKaRa公司酶切说明。

1.2.3 拟南芥的遗传转化

1.2.3.1 农杆菌GV3101感受态细胞的制备及转化(TSS法)方法参见精编《分子生物学实验指南》(奥斯伯)一步法制备和转化感受态细胞。

1.2.3.2 含有重组质粒的农杆菌的PCR鉴定

分别挑取28℃培养1-2d的YEB(含50mg/L Spe,50mg/L Rif)转化平板上的单菌落，以未转化的农杆菌作阴性对照，以植物表达载体质粒pH7WG2D-LcERF053为阳性对照，进行菌落PCR鉴定。

1.2.3.3 侵染花序法转化拟南芥

将含有植物表达载体pH7WG2D-LcERF053的农杆菌培养至OD₆₀₀为0.8-2.0，5500rpm离心10-15min，弃上清，菌体沉淀用MS渗透液重悬，调整OD₆₀₀为0.8-1.2，侵染拟南芥花序10-60sec，暗培养1d后正常培养，收集成熟的种子。

1.2.4 转LcERF053基因拟南芥的筛选与检测

1.2.4.1 转LcERF053基因拟南芥的筛选

将收集的T0代转基因种子，经75％酒精消毒5-20min，无菌水清洗3遍，晾干后，铺在含有潮霉素抗性MS平板上，4℃春化1-3d，光照培养箱培养6-15d，选取根长的长，且长出真叶的健壮幼苗，初步判断为转基因阳性苗，移栽至土盆，培养。

1.2.4.2 DNA水平的PCR检测

利用CTAB法小量提取含有潮霉素抗性的拟南芥基因组DNA，通过PCR检测进一步筛选阳性拟南芥植株。若扩增出了目标片段，而阴性对照中没有扩增出片段，即初步证明目的基因整合到拟南芥基因组中。

1.2.4.2 RNA水平的PCR检测

对DNA水平检测为阳性的拟南芥植株，利用TRIzol试剂提取总RNA，反转录获得cDNA作为模板，RT-PCR检测筛选阳性转化苗。方法参照实施例1中的1.2.1-1.2.2，PCR反应参数：94℃5min；94℃30sec,55℃30sec,72℃2min,30个循环；72℃10min；0.8％的琼脂糖凝胶电泳。

1.2.5 转基因拟南芥的耐胁迫分析

种子在盐胁迫下的发芽率实验：将野生型和转基因型拟南芥种子经消毒后，分别种在0mM、100mM、150mM的NaCl的MS平板上，春化1-3d，光照培养箱培养7-15d，每天观察、统计发芽情况、根生长情况等。

1.2.6 NaCl或干旱胁迫对转LcERF053基因拟南芥的成苗期的影响实验

在MS平板上培养10d后，选择生长一致、发育良好的转基因LcERF053植株和野生型拟南芥植株，移栽至土盆中，正常培养20d，分成两部分，一部分做对照正常培养，另一部分进行高盐胁迫处理或干旱处理。

高盐胁迫处理：用300mM的NaCl浇透，持续3周浇灌盐水，观察野生型和转基因苗生长情况，在此过程中每天注意观察表型，统计结果。

干旱处理：持续不浇水(约21d)直至野生型植株萎蔫接近死亡，观察转基因拟南芥生长情况，再浇水复活，观察野生型和转基因拟南芥生长情况，在此过程中每天注意观察表型，统计结果。

1.2.7 转LcERF053基因拟南芥的抗逆生理生化指标检测

常见的抗逆生理指标有相对含水量、电导率等；本实验中分别分析了在正常条件下和盐胁迫下转LcERF053基因拟南芥和野生型拟南芥的相对含水量和相对电导率变化情况。

相对含水量测定：分别测定在正常条件下以及高盐胁迫(用300mM NaCl浇透)下的转基因LcERF053拟南芥以及野生型拟南芥的相对含水量；所述的高盐胁迫处理是用300mM NaCl浇透，3天后按照以下方法测定植株的相对含水量：取待测的整个植株，用蒸馏水冲洗干净，吸水纸吸干表面水分，每个处理3棵单株，未处理的做对照，迅速测其鲜重，之后放入120℃干燥箱中干燥30min，80℃烘干24h至恒重，称量其干重。对上述测得的干、鲜重，采用公式：组织含水量(占鲜重％)＝(鲜重-干重)/鲜重×100％进行计算。

相对电导率测定：分别测定在正常条件下以及高盐胁迫(用300mM NaCl浇透)处理下的转基因LcERF053拟南芥和野生型拟南芥的相对电导率；所述的高盐胁迫处理是用300mM NaCl浇透，3天后按照下述方法测定植株的相对电导率：称取待测植株的叶片0.2g，洗净、剪碎，置于10mL EP管中，加入5mL去离子水，浸泡1h，测定电导率J1并记录，然后放入沸水浴中煮沸10min，冷却至室温测电导率J2并记录。相对电导率＝J1/J2×100％。

2实验结果与分析

2.1 植物表达载体的构建

2.1.1 植物表达载体pH7WG2D-LcERF053的构建流程图见图6

2.1.2 重组质粒的菌落PCR鉴定

在重组质粒的转化LB(Spe+)平板上，分别挑取20个白色单菌落，进行菌落PCR鉴定，结果20个单菌落都是阳性克隆，见图7。

2.2 含有表达载体的农杆菌PCR检测

将重组质粒pH7GW2D-LcERF053转化农杆菌GV3101，以转化后的农杆菌的菌液作模板，未转化的农杆菌作阴性对照，质粒做阳性对照，进行菌液PCR鉴定。检测结果表明，该重组质粒已成功转入农杆菌中，见图8。

2.3 转LcERF053基因拟南芥的检测

2.3.1 DNA水平的PCR检测

选取潮霉素抗性苗，剪取其叶片，采用CTAB法提取其DNA，以拟南芥基因组DNA为模板，以35s-F和LcERF053-R为引物，采用PCR技术，对潮霉素抗性苗进行DNA水平的检测。结果表明，检测的抗性苗30株中25株为阳性，阳性率约83.3％，植株PCR检测见图9，证明LcERF053已经整合到拟南芥基因组中。

2.3.2 RNA水平的PCR检测

分别选取DNA水平鉴定的25株阳性拟南芥植株叶片为材料，提取总RNA，以反转录获得的cDNA为模板，RT-PCR对阳性苗作进一步的检测。结果表明，25株经基因组DNA-pcr检测为阳性的植株叶片中，22株检测为阳性，阳性率85％，植株RT-PCR检测见图10。

2.4 转基因拟南芥种子盐胁迫下发芽率实验

野生型拟南芥种子在100mM、150mM的NaCl的MS平板上，培养6d，发芽率分别是51.83％和4.91％，而转基因LcERF053拟南芥株系1、4、10、12、13、14、16、19号在100mM、150mM的NaCl的MS平板上，培养6d，发芽率分别都达到了100％，可见LcERF053转基因拟南芥种子显著提高了耐渗透能力。

2.5 NaCl和干旱胁迫对转LcERF053基因拟南芥的成苗期的影响实验结果

高盐胁迫处理16d，野生型拟南芥和转基因LcERF053拟南芥开始出现表型差异，野生型拟南芥的叶片开始变黄，部分叶片干枯，生长受到严重抑制；而转基因拟南芥叶片翠绿，生长受到盐胁迫抑制。当高盐胁迫处理21d时，野生型拟南芥和转基因LcERF053拟南芥的表型差异更为显著，绝大部分的野生型拟南芥叶片都已干枯，90％的植株死亡，而转基因LcERF053拟南芥叶片仍是绿色，仅很少部分叶片开始呈现黄色，植株存活率为100％(图11)。由此可见，在高盐持续胁迫下，转基因LcERF053拟南芥具有很好的耐盐表型，在拟南芥中过表达LcERF053显著提高了转基因植株的耐盐性，证明转录因子LcERF053是AP2/ERF家族基因中关键的盐胁迫调控因子。

干旱胁迫21d后观察到100％的野生型拟南芥叶片萎缩、干枯至死亡，而100％的转基因LcERF053植株叶片翠绿，生长良好，说明转基因LcERF053具有很好的抗旱表型，复水3d后，野生型拟南芥并没有能够复活，而转基因LcERF053拟南芥苗很快茁壮地生长。

2.6 高盐胁迫下拟南芥的相对含水量和电导率变化结果，

在正常条件下，转基因LcERF053拟南芥和野生型的相对含水量相差不大，高盐胁迫3d，野生型相对含水量降低至70％，而转基因LcERF053的相对含水量保持在85％，显著比野生型含水量高(图12)，说明在盐胁迫下，转基因LcERF053拟南芥受离子毒害失水的程度较野生型轻，这与耐盐表型结果也一致；在正常条件下，转基因LcERF053和野生型的电导率都在20％左右，在高盐胁迫下，野生型电导率升至90％，转基因LcERF053的电导率为60％，显著比野生型的低(图12)，说明在盐胁迫下，转基因LcERF053拟南芥的细胞膜损伤程度较野生型的轻，可见转基因LcERF053拟南芥显著提高了耐盐性。