龙胆八氢番茄红素合成酶（PSY）基因的克隆与功能分析

摘要

类胡萝卜素是一系列呈现黄色、橙色和红色的萜类色素物质，存在于所有的光合器官中并具有抗氧化的特性，但动物体内不能直接合成类胡萝卜素，必须从食物中摄取。近年研究表明，除了含有β-紫罗酮环的类胡萝卜素是维生素A的前体外，许多其他类胡萝卜素在增加动物营养、增强人体免疫力等方面起到重要作用，另外由于它能清除细胞内的活性氧自由基，所以类胡萝卜素在防癌抗癌方面的功效也越来越受到重视。八氢番茄红素合成酶是催化类胡萝卜素生物合成的一个特异性酶，它将2分子的栊牛儿牻牛儿焦磷酸(GGPP)催化合成第一个类胡萝卜素——八氢番茄红素。研究表明八氢番茄红素合成酶基因是类胡萝卜素生物合成途径中的限速酶。在番茄、油菜、拟南芥和马铃薯中过量表达八氢番茄红素合成酶，相应组织中积累类胡萝卜素的水平显著提高，在番茄果实中提高了1.9倍，拟南芥种子中β-胡萝卜素平均提高43倍，油菜种子中提高50倍，马铃薯块茎中提高了8倍。 本研究应用分子生物学技术从龙胆(Gentiana lutea)花瓣cDNA文库中克隆到八氢番茄红素合成酶2和3(G1PSY2和G1PSY3)基因(cDNA)，经序列比对分析发现其与G1PSY1基因有高度同源性但又不完全相同。G1PSY2 cDNA核苷酸序列总长度为1923 bp，含有一段1275 bp的不间断开放阅读框(ORF)，497 bp的5'末端和151 bp的3'末端非编码区，在位于1770 bp的终止密码子(TAA)与多聚腺苷酸之间有poly(A)添加信号(AATAA)，位于1833-1837 bp。编码区起始于498 bp处起始密码子(ATG)，ORF编码一个含424个氨基酸残基的蛋白质，分子量为48298.65 D，等电点为8.79。G1PSY3 cDNA核苷酸序列总长度为1765 bp，含有一段1278 bp的不间断开放阅读框(ORF)，399 bp的5'末端和88 bp的3'末端非编码区，在位于1675 bp的终止密码子(TGA)与多聚腺苷酸之间有poly(A)添加信号(GATAAA)，位于1745-1750 bp。编码区起始于399 bp处起始密码子(ATG)，ORF编码一个含425个氨基酸残基的蛋白质，分子量为48399.75 D，等电点为8.79。 构建pUC-G1PSY2和pUC-G1PSY3表达载体，将pUC-PSY质粒与缺失八氢番茄红素合成酶(CrtB)基因的工程大肠杆菌pACCAR25△CrtB共转化进行互补实验，得到呈现出明显黄色的单克隆菌株，通过高效液相色谱分析，鉴定转化菌株的代谢产物为玉米黄质等类胡萝卜素。另外，我们将pUC-PSY质粒转入工程大肠杆菌pACCrtE (在大肠杆菌中可合成栊牛儿牻牛儿焦磷酸，GGPP)中。通过高效液相色谱分析，鉴定转化菌株经过量表达得到的代谢产物为八氢番茄红素，证明G1PSY2和G1PSY3 cDNA 编码的蛋白都具有八氢番茄红素合成酶活性。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

一、类胡萝卜素简介

1.类胡萝卜素的结构与功能

2.类胡萝卜素生物合成途径及其关键酶基因

3.类胡萝卜素生物合成相关基因的研究与应用

二、PSY基因的研究进展

1.番茄

2.马铃薯

3.油菜

4.水稻

5.玉米

三、本论文研究的目的和意义

材料与方法

一、实验材料

1.菌种和质粒：

2.常用抗生素及试剂(储存浓度)：

3.分子生物学实验材料：

4.缓冲溶液配方

5.培养基配方

6.主要仪器及设备

二、实验方法

1.质粒的构建

2.PSY基因的表达和检测

实验结果

一、龙胆GlPSY2和GlPSY3 cDNA序列分析

1.龙胆GlPSY2 cDNA序列分析

2.龙胆GlPSY3 cDNA序列分析

二、龙胆GlPSY1、GlPSY2、GlPSY3 cDNA序列比较

三、龙胆GlPSY1、GlPSY2、GlPSY3氨基酸序列比较

四、表达载体的构建

1.GlPSY2表达载体的构建

2.GlPSY3表达载体的构建

五、GlPSY基因的功能分析

讨论

参考文献

致谢

附：在读硕士期间发表的论文和在国际基因数据库中登录的基因