c-Abl激酶在整合素αvβ3介导的黑色素瘤细胞黏着和迁移中作用及机制研究

摘要

肿瘤细胞的浸润和转移是癌症高致死率的主要原因，而细胞浸润和转移的基础是细胞迁移。整合素作为细胞膜上的黏附分子，一方面通过胞内结构域与胞内的细胞骨架结合在一起，另一方面通过胞外的球状结构域与细胞外基质连接在一起，从而使细胞锚定在细胞外基质上。另外整合素还能够整合细胞内外的信号从而调节细胞的迁移，所以整合素对于细胞的迁移是非常关键的。αvβ3整合素在许多肿瘤细胞都有高表达，包括乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、黑色素瘤细胞和神经胶质瘤细胞。αvβ3整合素在肿瘤细胞的高表达与肿瘤细胞的发生发展密切相关，尤其是肿瘤细胞的浸润和转移。
　　整合素介导肿瘤细胞的黏附和迁移主要是通过与细胞骨架联系形成黏着斑，并通过黏着斑的组装与去组装的动态时空变化来实现的。整合素本身没有酶活性，其作用一般由一些相关的激酶来调节。c-Abl激酶作为细胞内的非受体酪氨酸激酶能够使许多蛋白分子磷酸化，激活相应的靶分子、调控细胞骨架的重组或基因的表达，从而参与细胞的凋亡、分化、衰老等多种生理过程，有研究报道认为它参与了细胞的迁移过程。
　　在本论文中，通过transwell、单层细胞划痕等迁移实验模型发现c-Abl激酶参与了PDGF诱导的αvβ3整合素介导的黑色素瘤A375细胞的迁移。并且通过免疫荧光双标记实验证实了二者存在共定位的现象。免疫共沉淀的实验结果表明c-Abl激酶与αvβ3整合素存在于同一个蛋白复合体中。通过体外激酶反应等实验发现c-Abl激酶与αvβ3整合素的相互作用依赖于c-Abl激酶活性的变化;同时c-Abl激酶对αvβ3整合素的调控不受F-肌动蛋白的影响，c-Abl激酶也没有参与αvβ3整合素与胞外配体结合引发的整合素outside-in的信号通路。
　　利用构建的c-Abl激酶几个不同的与其它蛋白相互作用关键结构域的GST融合蛋白的体外表达体系，通过GST-pull down实验证明了c-Abl激酶是通过它的SH3结构域与αvβ3整合素形成复合体的。还进一步证实c-Abl激酶是通过与talin蛋白直接连接来调控αvβ3整合素在细胞迁移中的功能的。通过点突变实验，发现c-Abl激酶SH3结构域中的89位和134位酪氨酸对于二者的结合均不是唯一的关键作用点。这些研究为揭示肿瘤细胞迁移的机制提供了可靠的数据，同时为进一步的深入研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

前言

一、整合素概述

（一）整合素家族的结构及组成

（二）整合素的配体

（三）整合素的功能

（四）整合素与肿瘤转移

（五）αvβ3整合素的研究进展

二、c-Abl概述

（一）c-Abl的基本结构

（二）c-Abl在细胞中的定位

（三）c-Abl活性调节

（四）c-Abl生理功能

三、Talin概述

（一）Talin的分布及结构

（二）Talin与整合素相互作用的结构及对整合素的活化

四、本论文的研究目的和意义

材料与方法

一、实验材料

（一）菌株和细胞

（二）抗体和蛋白

（三）试剂和酶类

（四）质粒

（五）主要仪器

（六）主要溶液和培养基

二、实验方法

（一）细胞培养

（二）细胞转染（c-Abl激酶的过表达或干涉）

（三）免疫荧光双标记实验

（四）流式细胞术分析实验

（五）细胞静止粘附检测

（六）细胞迁移实验

（七）蛋白质免疫共沉淀

（八）SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）

（九）免疫印迹

（十）质粒的构建

（十一）GST-pull down assay

（十二）激酶反应实验

（十三）Far Western实验

结果与分析

一、c-Abl激酶参与了PDGF-BB诱导的αvβ3整合素介导的黑色素瘤细胞的迁移

（一）肿瘤细胞高表达c-Abl激酶分子

（二）PDGF-BB能够诱导A375细胞的迁移

（三）c-Abl激酶参与了PDGF诱导的A375细胞的迁移

（四）PDGF诱导的黑色素瘤A375细胞迁移主要是整合素αvβ3所介导的

二、c-Abl激酶通过调节整合素αvβ3来影响细胞的迁移

（一）c-Abl激酶与整合素αvβ3在细胞中存在动态共定位关系

（二）c-Abl激酶影响αvβ3发生簇集增强A375细胞的稳定黏附

三、PDGF-BB刺激寻致c-Abl激酶和整合素αvβ3的相互作用

四、c-Abl激酶与整合素αvβ3的结合依赖于c-Abl激酶的活性

五、c-Abl激酶通过SH3结构域与αvβ3整合素的β3亚基相互作用

六、c-Abl激酶影响整合素αvβ3簇集不依赖于整合素αvβ3与配体的结合，也不依赖于细胞骨架

七、c-Abl激酶通过talin蛋白与αvβ3整合素相互作用

讨论

结论

本论文的主要创新点

参考文献

致谢

在学期间公开发表论文情况（2008-2011）