甾体类激素的化学发光免疫检测方法的建立及应用

摘要

睾丸酮丛毛单胞菌含有降解甾核的关键酶-17β-羟类固醇脱氢酶(17β-HSD)。在甾体类化合物存在时，睾丸酮丛毛单胞菌会分泌17β-HSD酶，进而通过许多酶的氧化甾核复杂代谢途径将甾体类化合物彻底降解。
　　本课题从睾丸酮丛毛单胞菌染色体DNA中克隆得到17β-HSD的基因，将其重组到质粒pET-15b中，得到重组质粒pET-15b～17β-HSD。然后又将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，并用1mMIPTG诱导大肠杆菌表达17α-HSD蛋白。菌体破碎后收集表达的蛋白，用镍柱进行纯化，制备了浓度为3.65mg/ml的17β-HSD蛋白。
　　17β-HSD蛋白免疫兔子，收集兔血清，制备了多克隆抗体。间接ELISA法确定多克隆抗体的最佳工作浓度为4000倍稀释。17β-HSD蛋白免疫小鼠，取脾细胞通过细胞融合技术与骨髓瘤细胞融合，获得了高效表达抗17β-HSD的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。然后制备抗17β-HSD的单克隆抗体，并用辛酸硫酸铵法和G蛋白亲和层析柱纯化了单克隆抗体。最后用辣根过氧化酶标记单克隆抗体，获得酶标抗体。间接ELISA法确定酶标抗体的最佳工作浓度为8000倍稀释。
　　用上述制备的多克隆抗体和酶标抗体建立了化学发光双抗体夹心法检测甾体类激素的方法，并用来初步应用。对新立城水库、伊通河、饮马河、长春市自来水四个地方的水样进行了检测，检测结果为0.621ng/ml、9.332ng/ml、5.287ng/ml、0.321ng/ml。高效液相检测结果与建立的方法检测的结果相符，证明了化学发光双抗体夹心法检测甾体类激素的方法的可行性和正确性。本方法化学发光强、检测灵敏，能高通量检测大量样品，为甾体类激素的检测提供了实验支持，为监测环境中甾体类激素的污染提供了一种新方法，也为建立科学完善的环境激素检测方法奠定了基础。