丁醇高产菌株的诱变筛选及发酵技术的研究

摘要

近几十年来，石油等资源被人类大量开采与使用，令能源形势日益严峻，而且环境污染越来越严重，全球的气候日益变暖，新能源的开发已经迫在眉睫。生物丁醇具有腐蚀性小、饱和蒸汽压低、和能量密度与汽油相似等特点，可直接将它添加入汽油而无需改造发动机。我国木质纤维储量大而且资源丰富，经水解后可以用来发酵产丁醇生物燃料。木质纤维原料替代传统粮食原料可以避免粮食危机的出现，并且降低生产成本。 本研究从美国ATCC购买了Clostridium saccharobutylicum BAA-117并利用单糖、混合糖、杨木纤维酶解液和添加混合糖的杨木纤维酶解液等碳源作底物进行丙酮丁醇发酵。研究结果表明:BAA-117对单糖的利用率为:混合糖＞葡萄糖＞木糖＞阿拉伯糖;杨木蒸汽爆破渣（将杨木通过蒸汽爆破后产生的杨木纤维）通过酶解后产生的总还原糖含量为46.80g/L，经过72h无添加发酵，丙酮、丁醇、乙醇总溶剂含量为6.25g/L，其中丁醇的产量为4.73g/L，ABE总溶剂的生产速率为0.09g/(L.h);补充培养基后总溶剂含量为9.53g/L，其中丁醇的产量为6.90g/L，ABE总溶剂的生产速率为0.13g/(L.h);添加一定比例的混合糖后，丁醇的产量达到7.28g/L，ABE总溶剂的生产速率为0.14g/(L.h)，比单杨木纤维发酵丁醇产量提高了58.80％。 采用紫外诱变Clostridium saccharobutylicum BAA-117的适合条件为紫外照射100s。经过YEM与BCP平板初筛和发酵复筛，得到了两株产量相对较高的突变株A-18、A-19。该两株突变株发酵产丁醇和总溶剂分别为8.26g/L、11.53g/L和7.73、10.52g/L，较原始菌株分别提高了23.80％、31.60％和15.90％、20.10％，经传代5次培养，突变株A-18丁醇产量较稳定。 通过Plackett-Burman设计以及Box-Behnken响应面设计，得到了突变株A-18最佳的培养基组成为:混合糖(葡萄糖27.50g/L，阿拉伯糖3g/L，木糖19.50g/L)50 g/L、硫酸铵3.50 g/L、MgSO4.7H2O0.40 g/L、酵母浸粉1.80g/L、KH2PO40.62 g/L、FeSO4·7H2O15 mg/L、CaCO34.50 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.70g/L。通过单因素实验获得突变株A-18的最佳发酵条件为:初始pH6.8、温度36℃、装液量75％、接种量9％。最终得到的总溶剂和丁醇产量分别为12.82、8.71 g/L，比优化前产量分别提高了11.20％，5.40％。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 丁醇性质及燃料优势

1．2 丙酮丁醇发酵的菌株

1．3 丙酮一丁醇发酵生产工艺

1．3．1 分步发酵法

1．3．2 连续发酵法

1．4 ABE合成途径及代谢调控

1．5 溶剂对菌株的毒害作用

1．6 高产丙酮丁醇梭菌的选育

1．7 研究目的及意义

2 不同碳源发酵产燃料丁醇

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验方法

2．1．4 测定方法

2．1．5 ABE与乙酸丁酸标准曲线

2．2 结果与分析

2．2．1 Clostridium saccharobutylicum BAA-117对单糖及混合糖的利用

2．2．2 无添加杨木发酵产丁醇

2．2．3 添加培养基的杨木发酵产丁醇

2．2．4 添加混合糖杨木发酵产丁醇

2．3 小结

3 紫外诱变及突变株的筛选

3．1 实验材料

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 BAA-117生长曲线的测定

3．2．2 菌悬液的制备

3．2．3 紫外诱变菌株BAA-117

3．2．4 高产菌株的筛选

3．2．5 遗传稳定性

3．3 结果与分析

3．3．1 BAA-117菌体生长曲线

3．3．2 诱变剂量的选择

3．3．3 平板筛选结果

3．3．4 发酵初筛结果

3．3．5 发酵复筛结果

3．3．6 遗传稳定性检测

3．4 小结

4 正交实验设计与响应面法优化培养

4．1 实验材料

4．1．1 菌种

4．1．2 实验仪器

4．1．3 培养基及培养方法

4．2 实验方法

4．2．1 发酵培养基单因素实验

4．2．2 Plackett-Burman实验设计

4．2．3 响应面实验

4．2．4 发酵条件单因素实验

4．3 结果与分析

4．3．1 发酵培养基单因素实验结果

4．3．2 MgSO4·7H2O质量溶度对发酵的影响

4．3．3 酵母浸粉质量溶度对发酵的影响

4．3．4 KH2PO4质量溶度对发酵的影响

4．3．5 FeSO4·7H2O质量溶度对发酵的影响

4．3．6 CaCO3质量浓度对发酵的影响

4．3．7 L-半胱氨酸盐酸盐质量溶度对发酵的影响

4．3．2 Plackett-Burman实验结果

4．3．3 Box-Behnken实验结果

4．3．4 发酵条件单因素实验结果

4．4 小结

5 结论与创新点

5．1 结论

5．2 创新点

参考文献

附录A 缩略词表

附录B 攻读硕士学位期间的主要学术成果

致谢