月月桂香精油提取研究及其调控基因AACT克隆技术

摘要

月月桂花香淡雅，微黄，四季开花，但其花量少，即使处于盛花阶段，花量也比同类花量少。月月桂花香是众多桂花中最淡的，几乎闻不到花香味，这限制了其观赏及商业应用。因此虽然桂花香精油广泛应用于医药和食品产业，而月月桂精油的提取及商业应用却不常见。
　　本研究发现月月桂香气较淡、香气成分时空表达差异具有较大的缺点，探索月月桂精油提取的最佳工艺，探索月月桂精油工业化提取的可能性，以月月桂精油提取量为衡量指标，优化月月桂石油醚萃取法提取工艺，得到最佳的提取条件。针对月月桂花香较淡的缺点，本研究通过克隆月月桂乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-CoAC-acetyltransferase，AACT)基因全长，并对其进行生物信息学分析，并试图构建AACT植物表达载体，为改善月月桂香气较淡、香气成分时空表达差异探索一条可行的道路。本文还研究了月月桂时空表达特点，为AACT植物表达载体转化受体植物提供理论支撑。实验的主要结果如下:
　　1.利用石油醚萃取月月桂香精油，其最佳提取工艺为:粉碎至20目，料液比为1∶5m/v，提取温度为60℃，提取4h。通过GC-MS技术分析检测香精油的香型成分，发现香气成分以醇类、酯类、酸类等物质为主，其中萜类物质占了85％以上，所有成分中角鲨烯的含量最高，为11.5986％，其中的单帖类物质如α-蒎烯、β-罗勒烯、水芹烯、莰烯、芳樟醇等的含量达到16.5957％，而紫罗兰酮和4-羟基-β-紫罗酮香的含量为12.1328％。
　　2.采用RACE技术克隆香精油成分的合成关键酶一乙酰辅酶A酰基转移酶(AACT)的基因，得到的cDNA序列长为1580bp，并对此基因进行生物信息学分析，月月桂AACT开放阅读框在80～1297 bp之间，共编码405个氨基酸;相对分子质量为41347.89 D;等电点为5.66，为疏水性稳定蛋白，属Cond-enzymes超家族，氨基酸序列比对和进化树分析都可以发现，AACT的保守性高，具有可靠性。
　　3.采用AACT基因的半定量表达分析观察AACT基因的组织特异性表达和时空差异表达，分析AACT在月月桂花瓣和叶子中不同季度的表达量水平及不同花期的表达量。基因表达半定量分析结果显示:春夏秋冬四季中月月桂花瓣中AACT的表达量相似度达99％，AACT表达量均为1.0241左右，上下偏差不超过0.0201;月月桂叶子中AACT的表达量随着季节的转换逐渐降低，AACT量从3月份的0.7740一直降为0.1200;同一季节，月月桂花瓣中AACT的表达量远远高于叶子中AACT的表达量，且随着季节变化差距越来越大，3、6、9、12月份月月桂花和叶子的AACT表达量差距分别在0.3、0.4、0.6、0.9，显著性明显;不同开花期的AACT的表达量相差较大，初花期的月月桂花瓣AACT表达量最高，AACT表达量为0.9左右，而凋谢期中AACT表达量最低为0.4左右。
　　4.利用BamH1-Kpn1双酶切和T4连接酶，将1218bp的AACT基因插入11633bp的pCMBIA2301质粒中，得到CaMV35s启动子驱动的OsAACT表达的植物表达载体，其长度约12848bp。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 月月桂概论

1．2 月月桂精油提取及香气分析技术

1．3 花香气物质时空表达研究进展

1．4 乙酰辅酶A酰基转移酶及其生物信息学研究进展

1．5 一种通用高效的复杂载体构建新方法

1．6 研究内容

1．7 研究目的和意义

2 月月桂香精油提取及成分分析

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 主要仪器与试验试剂

2．1．3 方法

2．2 结果与分析

2．2．1 月月桂花瓣香精油提取工艺优化

2．2．2 月月桂花瓣香精油GC-MS检测分析

2．3 讨论与结论

2．3．1 讨论

2．3．2 结论

3 月月桂乙酰辅A酰基转移酶基因全长克隆及生物信息学分析

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 月月桂AACT基因全长cDNA的扩增

3．2．2 月月桂AACT的序列分析

3．2．3 月月桂AACT的蛋白质结构分析

3．3 讨论

3．4 本章小结

4 AACT基因的时空差异表达

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 实验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 月月桂18S内参基因和OsAACT基因的扩增

4．2．2 月月桂AACT基因时空差异半定量分析

4．3 讨论

4．4 本章小结

5 AACT基因植物表达载体构建

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 实验方法

5．2 结果与分析

5．3 讨论

5．4 本章小结

6 全文总论及展望

6．1 全文结论

6．2 创新点

6．3 展望

参考文献

附录

攻读学位期间的主要学术成果

致谢